1、Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物分离工程,胡卫成,淮阴师范学院 生物科学学院,办公地址：生科院403,E-mail: hu_,目的与要求,掌握萃取分离、膜分离、色谱分离、亲和分离等的基本原理及其特点。能在实际工作中掌握几种分离技术的工艺过程及熟悉相关设备。能在生物产品产业化研究及工艺设计中合理应用相应分离技术。,3,国内杂志,膜科学与技术化工进展生物工程学报 现代化工化工学报高校化学工程学报化学工程CHIN J CHEM ENGI离子交换与吸附化学工业与工程,SCI杂志,BIOTECHNOL BIOENG SEP SCI CHEM TECHNOL BIOT CHROMATOG
2、 A MEMBRANE SCI SUPERCRIT FLUID MICROB TECH ENG SCI PURIF TECHNOL ENG J PURIF METHOD SCI TECHNOL 主编,化学工业出版社，2003,Bi,os,ep,ar,at,io,n,主要参考书,生物分离过程科学,刘铮、詹劲等 翻译,清华大学出版社，2004,Bi,os,ep,ar,at,io,n,主要参考书,Bioseparations Science and Engineering,Roger G. Harrison et al,Oxford University Press , Inc.
3、ISBN: 0-19-512340-92003.,Bi,os,ep,ar,at,io,n,课程内容和安排,教材：生物分离工程第二版，孙彦编著,第1章、绪论,第2章、细胞分离和破碎第3章、初级分离第4章、膜分离第5章、萃取第6章、吸附分离技术和理论第7章、液相色谱,第8章、亲和色谱第9章、电泳和电色谱,第10章、蛋白质复性第11-12章、结晶和干燥,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物分离工程,第一章. 绪论,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物工程的地位,生命科学,生物工程,生物技术产业Bioengineering,Bi,os,ep,ar,at,io,n,围绕生物技术产品的相关
4、技术支撑基因工程,微生物工程菌发酵工程,蛋白质或酶蛋白质工程或酶工程生物分离工程,动、植物个体或细胞优良的动植物品系细胞工程产品,Bi,os,ep,ar,at,io,n,物,发,的,术,离,物,发,术,生物分离工程的发展,生,分,技,展20世纪后半叶20世纪中叶,20世纪上半叶20世纪前,生,技,的,展,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物技术的发展历史20世纪前,利用自然界中的微生物来制酒、酱、面包、奶酪等各种食物疾病的预防,不分离或简单分离,我国古代的酿酒作坊,种牛痘预防天花,做豆腐,蛋白沉淀、过滤、干燥、,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物技术的发展历史20世纪上半叶（
5、1900-1940）筛选和培养微生物来生产特殊的产品，典型例子发酵生产丙酮/丁醇/乙醇德国科学家Weizmann将筛选获得的厌氧菌株用于工业化发酵1940年,丁醇和丙酮的年产量已经超过45,000 和 90,000 吨。,有机溶剂,蒸馏、精馏等技术,这个时期的生化产品相对比较简单，基本上是无活性的小分子（有机溶剂）。此时开始引入化学工程中较成熟的近代分离技术，如过滤、蒸馏、精馏等，生产多以经验为主。,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物技术的发展历史,20世纪中叶（1941-1970）,抗生素时期或液体深层耗氧发酵时期,典型产物：抗生素 (antibiotics) 、氨基酸(amino
6、 acids)、 酶 (enzymes) 。,萃取、沉淀,吸附,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物技术的发展历史,20世纪后半叶（1971-）,基因重组技术被用于工业生产蛋白质第一个基因蛋白胰岛素 insulin,大量投资生物技术，成千上万生物技术公司相继成立。,生物大分子精细分离：层析、电泳等,Bi,os,ep,ar,at,io,n,现代生物技术,生物技术产品,现代生物分离技术,Bi,os,ep,ar,at,io,n,现代生物产品的开发流程,From Mind to Market,(1) Genetic Engineering(9) Product(2) Cell-line dev
7、elopment(8) Clinical test(3) Fermentation(7) registration(4) Downstream(6) Quality control(5) Formulation,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物分离工程,生物分离工程,酶反应液、细胞培养液或组织提取液等进行分离和纯化的过程，以获得高纯度的目标产物。, 生物过程工程的关键环节 生物技术产业化的瓶颈,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生化反应所起的作用是产生目的产物，指标是,产率和转化率，而生化分离解决的是如何从反,应液中获取这些物质，涉及的是收率和纯度。,生化分离的主要任务：从发
8、酵液和细胞,培养液中以最高的效率、理想的纯度、最,小的能耗把目的产物分离出来。,生化分离的任务,Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物分离工程Fermentation,“上游过程”,“下游过程”,Downstream Processing过程兼容、协调，全程优化BioprocessBioproduct Engineering生产的成本23,Bi,os,ep,ar,at,io,n,对于一般的化工过程，用于分离部分装置的投资,和操作的费用，要占整个过程的6070%以上，其,能耗达到8090%之多，对于生化过程而言，用于,分离部分的投资、操作费用以及能耗等，往往高于,以上水平。,生物分离的投资
9、和操作的费用,24,Bi,os,ep,ar,at,io,n,26,产物浓度产品售价,Crude product concentration versus selling price (taken from Dwyer, 1984),Bi,os,ep,ar,at,io,n,生物分离的对象,1) 胞外产品: 产物作为细胞的代谢产物被分泌于培,养液中,2) 胞内产品: 产物被留在细胞内部,a. 以包涵体(inclusion bodies)形式存在b. 在细胞周质内或细胞的其它部位,3) 天然产物: 不需经过细胞培养或发酵的体系，包,括固体物、固体的提取物以及各类溶液,Bi,os,ep,ar,at,i
10、o,n,生物分离的一般过程发酵液或培养液,胞内产物细胞破碎固液分离浓缩,胞外产物,产物捕获阶段,CaptureIsolationconcentration,初步纯化纯化精制,纯化阶段精制阶段,PurificationPolishing,产品31,生物工程产业领域生物制药（抗生素，基因重组蛋白，氨基酸，疫苗，菌苗，天然药物，生化药物，血液制品，抗体，多糖，多肽）生物化工（乳酸，柠檬酸，苹果酸，丙烯酸，甘油，异丙醇，乙烯）生物能源（甲醇，乙醇，生物柴油，生物汽油）生物材料（明胶，胶原蛋白，人造皮肤，人造骨，人造脏器）生物医学 （诊断试剂，基因治疗，人及生物克隆）环境生物（环境治理，水污染，土壤污染
11、，风沙治理）生物食品（醋，啤酒业，酿酒，乳制品，奶制品）生物资源（动物，植物，微生物）生物农业 （基因食品，基因植物）,生物工程的上中下游上游：菌种，基因工程，分子生物学，遗传学中游：微生物发酵工程，动植物细胞， 海洋生物培养下游：生物分离工程生物产物的特点产物浓度低的水溶液 (原因：氧传递限制；细胞量;产物抑制） 组分复杂(大分子;小分子;可溶物;不可溶物;化学添加物）产物稳定性差(化学降解pH , 温度;微生物降解酶作用，染菌）质量要求高 （药品或食品）,生物分离是生物加工过程的重要组成部分从发酵液、酶反应液或动植物细胞培养液中将生化产物分离、提取并精制的一门工程学科生物产物的生产过程称为
12、生物加工过程。包括：上游技术：优良生物物种选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程（酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等），下游技术：目标产物的分离纯化，包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。下游加工过程的重要性主要体现在生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性上，导致下游加工过程的成本往往占整个生物加工过程成本的大部分。工业酶分离：70%基因重组蛋白质药物的分离：85-90%发酵乙醇的分离：14%,生物分离过程的特点生化产物的稳定性差，产物可能失活生物物质的生物活性大多是在生物体内的温和条件下维持并发挥作用的，当遇到高温、pH值的改变以及某些化学药物存在等周围环境的急剧变化时极
13、不稳定。产物失活的机制是化学降解或因微生物引起的降解在化学降解的情况下，产物只能在窄的pH值和温度变化范围内保持稳定。蛋白质一般稳定性范围很窄；对于小分子生化产物，可能它们在结构上的特性在极端pH条件下会受损；具有手性核的分子，则可能由于pH值、温度和溶液中存在的某些物质催化而被外消旋，导致产物的大量损失。,微生物降解作用是因为所有细胞中存在不同的降解酶，如蛋白酶、脂酶等，都能使活性分子破坏成失活分子。由于升温能够加速这些降解酶的作用，因此在制备蛋白质、酶或相似产物时，应在尽可能低的温度下操作。另外还应防止发酵液染菌，这可能导致产生毒素和降解酶，从而引入杂质或导致产品的损失。严格控制操作条件，
14、维持生物物质的生物活性；需采用快速的分离纯化方法除去影响目标产物稳定性的杂质，如蛋白酶等,分离难度大，一般需用特殊的高效分离技术原料液中常存在与目标分子在结构、构成成分等理化性质上极其相似的分子及异构体，形成用常法难于分离的混合物生物产物的原料构成成分复杂，需要采用多种分离技术和多个分离步骤完成一个目标产物的分离努力开发新型高效的分离纯化技术对最终产物的质量要求很高生物产物一般用作医药、食品和化妆品，因此，要求除去有害人体健康的物质，如热原和具有免疫原性的异体蛋白等；需对原料液进行高度浓缩原料液中目标产物的浓度一般都很低，甚至是极微量的，有必要对原料液进行高度浓缩，从而使下游加工过程的成本显著
15、增大。,表1 国内外已商业化生产的现代生物技术产品举例,不少明星依靠注射内源性生长因子注射除皱(ACR) 来保持青春,与此同时，人们注意到了下游分离技术对发展现代生物技术及其产业化的重要性，分离技术的落后会严重阻碍生物技术的发展。国内外纷纷加强对生物分离技术的研究力量，增设研究机构和加大资金投入，一些公司和生产企业也在生物分离技术领域展开竞争。,按分子量大小分类 MW 1000Da：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质、核酸类按目的产物所在的位置分类 胞内产品：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 胞外产品：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等 细胞产品：酵母、单细胞蛋白,Bi,os,ep
16、,ar,at,io,n,分离过程的控制参数分离度Resolution,速度Speed,Recovery收率,处理量Loadabilitycapacity,Bi,os,ep,ar,at,io,n,分离过程捕获阶段分离度Resolution,速度Speed,Recovery收率,处理量Loadability,Bi,os,ep,ar,at,io,n,分离过程纯化阶段分离度Resolution,速度Speed,Recovery收率,处理量Loadability,Bi,os,ep,ar,at,io,n,分离过程精制阶段分离度Resolution,速度Speed,Recovery收率,处理量Loadabi
17、lity,Bi,os,ep,ar,at,io,n,Purification Protocol Development,1. Required purityand quantity2. Physical-chemical,4. Separation techniqueknowledge,properties of target andmain contaminants,Purification,5. Purificationstrategy,protocol3. Source material,information,7. Economy andresources,6. Scouting run
18、sand optimization,Bi,os,ep,ar,at,io,n,“难度大、成本高”,（力,生物分离过程的特点,1 处理对象的规模相差大；,2 发酵液或细胞培养液中组分多，容易失活；3 一般目标物的含量很低，产品纯度要求高；4 许多生物质的特性都将影响分离技术的选择；5 可供选择的分离方法也不是很多；,6 缺少相应的各种生物质的理化性质的数据库,学性质、热力学性质、传质性质、电磁性质、化学平衡性质、反应动力学、光化学性质、生物亲和作用、生物膜输送性质、免疫性质等等）,Bi,os,ep,ar,at,io,n,分离过程应注意的问题,1. 目标产物的纯度 分离的目标；,2. 在保证纯度的前
19、提下，提高得率 减少损,耗；,3. 提高每一单元的收率；,4. 降低成本 投资成本、操作成本和原料成,本；,5. 缩短流程和简化工艺过程；6. 降低对环境的负担。,Bi,os,ep,ar,at,io,n,分离过程应注意的问题,Biosafety 生物安全,In Research,In Production,40,Bi,os,ep,ar,at,io,n,千差万别,不同的对象,需要采用,不同的分离过程,生物分离对象的差别小分子（溶剂、抗生素）蛋白质（细胞因子、激素、抗体、酶）核酸（基因治疗药物）病毒,细胞,n,Bi,os,ep,ar,at,io,Citric Acid Production,Bi,
20、os,ep,ar,at,io,n,Insulin Production Flowsheet,Bi,os,ep,ar,at,io,n,选择分离方法的依据,生物大分子的复杂性,不同分离机理的多种因素共同作用,Bi,os,ep,ar,at,io,n,1 物理化学性质: 分子大小、分子量、分子体积、极,性、偶极矩、熔点、沸点、汽化热、离子电荷、溶解,度、折射率、表面张力、介电常数、密度、黏度、酸,碱强度、pK值、等电点(pI)等等。,2 生物体系的特性: 生物分子间的分子识别，还包括,溶剂、pH值、温度等等对生物活性的影响。,3 缓冲液的影响： 维持体系有相对稳定的pH环境，,磷酸盐缓冲液可维持pH在
21、7左右，Tris缓冲液(三羟甲,基氨基甲烷缓冲剂)用于制备pH=7.29.2的缓冲液 。,选择分离方法的依据,Bi,os,ep,ar,at,io,n,1 平衡分离过程: 利用被分离各组分在两个或两个,以上物相中平衡分配率之间的差异进行分离，有萃,取、精馏、吸附、层析、蒸发、结晶等。,2 机械分离过程: 主要包括利用比重不同、颗粒大,小不同等过程，大都是一些固液分离方法，如沉降、,离心、过滤等。,3 迁移速率控制的分离过程（输送分离）：利用待分,离组分在一定的力场、电场中迁移速率不同或者迁移,方向相反来达到分离目的，如电泳、电渗析、磁泳、,凝胶过滤等。,分离过程的分类,设计中应考虑下列问题,1.
22、 What is the value of the product? （产品价值）2. What is an acceptable product quality? (产品质量）3. Where is the product in each process stream? （产物在生产过程中出现的位置）4. Where are the impurities in each process stream?（杂质在生产过程中出现的位置）5. What are the unusual physicochemical properties of the product and the principa
23、l impurities? （主要杂质独特的物化性质是什么？）6. What are the economics of various alternative separations? （不同分离方法的技术经济比较）,方法选择的基本原则,设计前应了解的信息,1）在设计前，首先要掌握的产物物化性质，主要包括：(1)溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等；(2)分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义；(3)沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义；(4)极性大小；(5)分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等；(6)功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据；(7)免疫原性
24、。设计亲和色谱；(8)稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)；(9)分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等；(10)等电点pI；,2）成品规格（或产品质量标准） 五肽胃泌素的上海市药品标准 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25 -29 吸收值比 A(280nm):A(288nm) =1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，% 0.5,3）进料的组成和物性 (1)目的产物的浓度。高？低？ (2)物料中的与目的产物相近物质组成的物理 化学性质。 (3)目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4
25、)菌种的种类和形态。 (5)微生物的含量和发酵液的黏度。,4）生产规模 5）危害性(1)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。(2)目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。(3)试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。6）分批分离还是连续纯化,1)尽可能简单、低耗、高效、快速。反面例子 - 中药现代化、超临界萃取；2)分离步骤尽可能少。Why? A)、 n 为总回收率，n 为各单元回收率。意义？分离步骤越多，回收率越低；如10 = 0.
26、9510 = 0.63，5 = 0.955 =0.77B)、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长 How ?,几个原则,3)避免相同原理的分离技术多次重复出现比喻，分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。4)尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 A)、引起新的化学污染；B)、蛋白质的变性失活5)合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。,对环境的考虑,1）废水 A、除菌过滤和灭菌处理； B、符合BOD的要求；2）废料 A、灭菌处理； B、综合利用：动物饲料、饲料添加剂，有机肥料；3）废气
27、A、除菌过滤和灭菌处理； B、废气（有机溶剂）回收；4）溶剂的回收 A、减少环境排放，减少污染； B、循环利用，减低成本 ；,Bi,os,ep,ar,at,io,n,大小 、形状 、电荷 、电荷分布、等电点 、疏水,性 、溶解度 、密度、配合体结合能力、金属结合,能力、可逆性缔合、翻译后修饰 、特异性序列或,结构 、基因工程构建的纯化标记、非寻常性质,蛋白质分离的依据,用作分离和纯化依据的蛋白质性质,47,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质性质,a. 大小：多数蛋白质的分子量在10-1500 kDa,b. 形状：蛋白质的形状有近似球形的，也有不对称的c. 电荷：蛋白质的净电荷取决于
28、氨基酸残基所带正负,电荷的总和,d. 等电点：蛋白质的等电点一般在4.0-10.0之间e. 电荷分布：蛋白质表面的电荷分布可以是均匀的，,也可能成簇地分布,48,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质性质,f. 疏水性：蛋白质表面存在少数疏水性残基,g. 溶解度：可变因素包括pH、离子强度、离子性质、,温度和溶剂的极性,h. 密度：多数蛋白质的密度在1.3-1.4 g/cm3,i. 配合体结合能力：许多酶可与底物、效应分子、辅,助因子和 DNA 模板结合,j. 金属结合能力：特定地金属离子，如Cu2+、Zn2+、,Ca2+、Co2+、Fe2+、Ni2+等,49,Bi,os,ep,ar,
29、at,io,n,蛋白质性质,k. 翻译后修饰：许多蛋白质在合成后还要通过加入糖,基、酰基、磷酸基团或其他基团进行修饰,l. 特异性序列或结构：氨基酸残基在蛋白质表面上的,精确几何表象可以作为分离方法的基础,m. 基因工程构建的纯化标记：通过基因工程在被表达,蛋白的氨基端或羧基端加入特定的氨基酸序列,n. 非寻常性质：如热稳定性、抗蛋白酶解特性,50,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,组成蛋白质的主要氨基酸有：,20种 L-型-氨基酸,51,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,氨基酸的基本结构侧链氨基,不同的氨基酸羧基52,Bi,os,ep,ar,a
30、t,io,n,蛋白质结构和特性,20种氨基酸1. 非极性、疏水、中性2. 极性、亲水、中性3. 极性、亲水、酸性4. 极性、亲水、碱性53,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,蛋白质是由氨基酸缩合而成的线型分子，在形成蛋白质时，两个相邻的氨基酸的羧基和氨基之间脱去一分子水而形成肽键。许多氨基酸经由肽键连成的线形长链称为多肽链。,n25: 蛋白质,54,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性蛋白质(Protein)的结构蛋白质的结构可以按四个层次描述：一级结构：,二级结构：三级结构：四级结构：,?,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,
31、一级结构,蛋白质的一级结构就是其化学结构，也就是组成多肽链的氨基酸的排列顺序。对于存在肽链内部的双硫键或肽链之间的双硫键的蛋白质，则还包括双硫键的位置。,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,二级结构,多肽链通过氢键排列成沿一维方向具有周期性,结构的局部构象。如-螺旋和-折叠。,-螺旋,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,-螺旋,疏松的,紧密的,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性-折叠,平行的,反向的,Bi,os,ep,ar,at,io,n,。,蛋白质结构和特性三级结构二级结构的基础上，借助非共价键（次级键）盘绕成具有特定肽链走向
32、的空间构象。,磷酸果糖激酶,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,-折叠构成的蛋白质,核质蛋白,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性,-螺旋构成的蛋白质,血色素,Bi,os,ep,ar,at,io,n,寡聚酶,蛋白质结构和特性四级结构很多蛋白质以三级结构的蛋白质亚基的多聚体形式存在，从而构成蛋白质的四级结构。,亚基,二聚体,八聚体,Bi,os,ep,ar,at,io,n,蛋白质结构和特性酶与辅酶有些酶除了蛋白质部分外，还有小分子的非蛋白质部分，称为辅酶。辅酶通常与酶的催化作用相关。,全酶,酶蛋白活性中心,辅酶蛋白质链,2. 分离过程和产品角度 浓缩程度
33、分离纯化程度 回收率,分离过程,原料C,FC,cTC , cXC,产品P,废料W,FP,cTP , cXP,FW,cTW , cXW,浓缩率,分离(纯化)因子Purification factor,a: 单位体积溶液目标产品活性（U/mL或U/L ）,连续操作,生物分离工程的发展趋势,（1）操作与方法集成化（2）亲和技术推广与配基合成（分子印迹）（3）优质层析介质开发（大孔亲水介质，贯注层析介质）（4）下游技术与上游技术相结合（5）改进上游因素（菌种，培养基与发酵条件）（6）改善环境相容性,存在的问题：研发费用高、成本高、周期长 生物工程发展的瓶颈 如何解决？1)、加强基础理论研究 A、研究非理想溶液中溶质与添加物料之间的选择性机制、影响因素 B、研究界面的结构、动力学和传质机制，以及影响因素 C、下游加工过程的数学模型的建立和计算机模拟。难 2)、完善老技术：正确对待“新”、“老”分离技术,3)、发明新技术 研发新型高效经济的分离技术 推进各分离技术的杂交 分离技术与发酵技术结合 强化化学对分离技术的影响4)、高效分离技术的工程化5)、分离技术的环保化,
