1、实验十二 杀菌剂的生物测定孢子萌发法,一、试验目的,学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一-孢子萌发法。,将孢子培育在含有一定药剂的介质中，在保温、保湿条件下培养一定时间后镜检，根据杀菌剂对病原真菌孢子萌发抑制作用来测定药剂的生物活性。,二、试验原理,含药介质,孢子,其他药剂选用合适的溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、乙醇等）溶解，用0.1%的吐温80无菌水溶液稀释。根据预备试验，设置5-7个系列质量浓度，有机溶剂最终含量不超过2%。,三、实验步骤,（1）药剂配制,水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释,（每毫升1105-1107个孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液）,（2）孢子悬浮液配制,培养基上的病原真菌孢子,洗
2、脱,过滤,离心,（1000r/min）5min,倒去上清液，加入去离子水,离心,去离子水将孢子重悬浮,然后架放于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度的培养箱中。,（3）药剂处理,低浓度,高浓度,孢子悬浮液,0.5mL,药液,0.5mL,混合均匀,微量加样器,凹玻片,四、结果调查与统计分析,当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别记录萌发数和孢子总数。孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。同时还应观察记录芽管生长异常情况、附着胞形成数等。,实验结果统计, 计算各处理的孢子萌发相对抑制率，采用浓度对数-几率值法计算各药剂的EC50、EC90,标准误及其95%置信限，评价供试药剂对靶标菌孢子萌发的抑制活性。, 但在观察试验结果时，除要观察孢子萌发与不萌发这两种截然不同的形态外，更要注意萌发芽管的形态变化，即芽管是否有膨大现象，是否有附着器形成，附着器颜色的深浅，发芽管长度、以及侵入菌体形成情况等，即从微细观察中来了解药物的作用方式。, 孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。,
