1、细胞酸性蛋白碱性蛋白的显示 【目的要求】 一、熟悉细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的化学反应染色一般原理及方法 二、了解蟾蜍红细胞内酸性蛋白和碱性蛋白在细胞中的分布 【实验准备】 一、实验材料：活蟾蜍。 二、试剂：二甲苯、70乙醇、5三氯醋酸、乙醚 1NHCl。 三、染色液。 (一)三种母液(实验前配制) 甲：0.2固绿染液 乙：1/75N HCl(稀释一倍后 pH=2.02.5) 丙：0.05Na2C03(稀释一倍后 pH=8.08.5) (二)二种蛋白质溶液(实验时混合) 1、酸性蛋白固绿染液 甲+乙(1：1)，即为 0.1酸性固绿染液(1/150NHClPH=2.02.5)o 2、碱性蛋白固绿染
2、液 甲+丙(1：1)，即为 0.1碱性固绿染液(0.025Na2C03，PH=8.08.5) 三、Schiff 氏试剂(亚硫酸晶红液) 四、器械：染色器皿，水浴箱，取材制片器械，显微镜等 o 【实验原理】 蛋白质的基本组成单位是氨基酸，它们同时具有氨基和羧基(在溶液中主要以NH 3+，COO 式存在)，而自由氨基和羧基的游离取决于溶液的 pH 值，当蛋白质处于酸性溶液时，由于该溶液中正离(OH )多，从而抑制蛋白质中的COOH 电离，于是造成蛋白质带正电荷多；当蛋白质处于碱性溶液时，由于该溶液中负离子(OH )多，从而促使蛋白质中的 COOH 都电离成 COO，于是造成蛋白质带负电荷多；当蛋白
3、质处于某一种 pH 溶液时，它恰好带有相等的正负电荷(呈兼性离子)。此时的 pH 值称为等电点(pL)，由于蛋白质除了末端氨基和末端羧基之外，还具有许多侧链，其上的许多基团在溶液中也都可以电离，因此，一个蛋白质分子表面四周都有电荷。不同蛋白质分子所带有的碱性基团和酸性基团的数量不等，故它们的等电点也不一样。因此蛋白质分子所带的净电荷取决于：(1)分子中碱性基团和酸性基团含量。(2)所处溶液的 pH 值，如在生理条件下，整个蛋白质带负电荷多。为酸性蛋白质(等电点偏向酸性)；带正电荷多，为碱性蛋白质(等电点偏向碱性)。据此，可将标本经三氯醋酸处理后，用不同pH 的固绿染液(一种弱酸性染料，本身带负
4、电荷)，予以染色，可使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白分别显示。 【实验操作】 1、取材和涂片：将蟾蜍用乙醚麻醉后，剪开胸腔，打开心包，取心脏血滴一滴在干净载玻片一端，以另一玻片的一端紧贴在已滴血载玻片上，均匀用力，呈 45轻轻向前推去，使血液在玻片上涂成一均匀薄层，制成的涂片室温晾干。2、固定：将晾干的涂片浸于 70乙醇中固定 5 分钟，清水冲洗净。 3、三氯醋酸处理：将已固定涂片浸于 5三氯醋酸，60处理 30 分钟，清水冲洗(注意一定要反复洗净，不可在涂片上留下三氯醋酸痕迹，否则酸性蛋白和碱性蛋白的染色不能分明)。 4、染色和镜检：将显示酸性蛋白的涂片在 0.1酸性固绿染液中染 510分钟。清
5、水冲净。将显示碱性蛋白的涂片在 0.1碱性固绿染液中染 30 分钟1 小时 (视染色深浅而定)。清水冲净后将上述二张涂片镜检观察。 【实验结果】 用 PH2.02.5 酸性固绿染液染色结果，整个细胞质和核仁中蛋白质均被染成绿色，此即酸性蛋白在细胞内的分布，而胞核中染色质并不染上色(但时间太长可能染上色)。有 pH8.08.5 碱性固绿染液染色结果，只有细胞核内染色质被染绿色，此即碱性蛋白在细胞内的分布，而胞质及核仁并不染上色。 【注意事项】 1、在制作血涂片的过程中要用力均匀，避免来回推拉及刮片、好的血涂片在显微镜观察到的细胞应该是单层均匀排列。2、取血滴不宜太大，以免涂片过厚，影响观察。3、涂片厚薄适中。注意拿片的姿势，推片角度和速度要适中，要用力均匀。4、涂片一般后半部观察效果比较好。
