1、,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR医学和科研中的应用,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR
2、技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理 定量原理,介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同
3、时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,在扩增产物达到阈值线时:
4、XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样
5、品中所含的模板量,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记：1、 SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon4、Amplisensor,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,S
6、YBR Green 法 工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR Gree
7、n 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNA,SYBR Green 法 应用范围,起始模板
8、的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,
9、TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取
10、病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,数据分析,分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,TaqMan法 应用范围,起始模板的定量基因型分析目的基因定量产物鉴定SNP分析,TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分
11、子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光-变性过程：产生非特异性荧光-延伸过程：不产生荧光-退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 应用范围,起始模板的定量基因型分析产物鉴定SNP（单核苷酸多态性）分析,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理实时荧光
12、定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA,实时荧光定量PCR法 标准样品DNA拷贝数,用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释,实时荧光定量PCR法 定量方法,绝对定量检
13、测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）2-C（t）双标准曲线法,实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异,TaqMan法举例 标记探针,使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针,TaqMan法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析Controls no RNA：阴性对照 RNA + n
14、o reverse transcriptase：基因组对照,TaqMan法举例 反应程序,RT-qPCR 反应程序：,TaqMan法举例 癌症标记物表达,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,TaqMan法举例 实验结果 单双通道相互验证,TaqMan法举例 实验结果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,21
15、30/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 表达差异,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,TaqMan法举例 实验结果 讨论,通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍,实时荧光定量PCR法 SYBR Green I法举例,利用SYBR Green 1进行GMO
16、定量 (SGI) for GMO soy detection,SYBR Green I法 GMO概念,转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。,SYBR Green I法 GMO概念,1983年：首例转基因植物转基因烟草 1986年：转基因植物首次进入田间实验 1994年：首例转基因植物产品Flavr Savr 延熟保鲜转基因番茄进入市场 1996年至今：转基因作物迅猛发展期,SYBR Green I法 检测方法,转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、
17、目标基因、报告基因通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization)利用插入基因的定量来进行GMO含量检测,SYBR Green I法 材料准备,Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56）普通非转基因大豆从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品： 大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉,SYBR Green I法 样品制备,标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 转基因大豆实验样本 从含大豆成分的样本中提取DNA,SYBR Green I法 引物设计,Lectin扩增片段长度为318bp其引物为
18、：正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3，反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3 EPSPS扩增片段长度为356bp其引物为：正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3,SYBR Green I法 C（t）定量,log A/B = logA- logB A: EPSPS GMOB: Lectin all beanA/B: %GMO,SYBR Green I法测GMO 数据收集与分析,标准曲线log%GMO对应C（t）获得
19、熔解曲线分析，检测扩增产物,数据处理：C（t）EPSPS-C（t）lectin=C（t） 处理条件：假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。,SYBR Green I法测GMO 熔解曲线分析,Tm = 92oC,Tm = 88.5oC,SYBR Green I法测GMO 实验结果1:标准曲线,不同转基因成分含量与Ct epsps做标准曲线,Cp4-epsps,SYBR Green I法测GMO 实验结果2: 样品的扩增曲线,SYBR Green I法测GMO 实验结果： 定量分析,SYBR Green I法测GMO 实验结果 定量分析,Calculate C(t) = C(t) epsp
20、s C(t) lectin,SYBR Green I法测GMO 实验结果 标准曲线生成,根据C(t)值与标准品百分含量做标准曲线,SYBR Green I法测GMO实验结果 GMO定量,根据C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量,SYBR Green I法测GMO 实验结果 讨论,用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品 分别提取DNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度,SYBR Green I法测GMO 讨论 PCR扩增效率,看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是：cDNA样品在100倍浓度梯度稀释后扩增产物CT如何变化斜率绝对值接近于0,为保证上述假定成立，即ExA= ExB 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件,谢 谢！,
