1、专题3,植物组织培养技术,一、基础知识,1、植物的组织培养,（1）细胞的分化,概念：,在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程,过程：,如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统,特点：,（2）稳定性：,（3）全能性：,（1）持久性：,是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度,细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的,已分化的细胞，仍具有发育的潜能,原因：,基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果,结果：,形成不同的细胞和组织,（2）细胞的全能性,定义：,生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性,原理：,生物体的每一
2、个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因,高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质,已分化的植物细胞，仍具有全能性,实例,受精卵生殖细胞体细胞,全能性的比较:,（3）植物组织培养,细胞离体,必要条件：,一定的营养物质、激素和其他外界条件,原理:,细胞的全能性,外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官,相关概念:,脱分化：,再分化：,愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞,人参的愈伤组织,菠萝的愈伤组织,2、影响植物组织培
3、养的因素,（1）植物材料的选择,烟草和胡萝卜的组织培养较为容易,枸杞愈伤组织的芽诱导比较难,同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果,菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝,（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基,MS培养基主要成分包括：,A、大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等,C、有机物、植物激素,讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖
4、提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。,常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素,生长素类：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,细胞分裂素类：,激动素（KT）、6苄基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素类：,赤霉酸（GA3）,（3）植物激素的影响,生长素和细胞分裂素作用,植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分
5、裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促进愈伤组织生长,生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响,（4）pH、温度、光照,pH控制在5.8左右，温度控制在1822。C,每日用日光灯照射12h,3、植物组织培养过程:,离体组织或细胞,植物体,细胞分裂素生长素,愈伤组织,芽,根,细胞分裂素生长素,细胞分裂素生长素,植物细胞培养,不需要光,需要光,1、培育无病毒植株,2、 培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）,4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方
6、法,4、植物组织培养的应用：,3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题,人工种子,二、实验操作,（一）制备MS固体培养基,MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备,1、配置各种母液,无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存,激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液,用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量,2、配置培养基,分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml, 配制培养液,
7、调PH,培养基的分装,由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素,3、灭菌,分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌,1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝,（二）外植体消毒,2、消毒,流水冲洗,菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右, 酒精处理,用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗,消毒液处理,取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液,（三）接种,污染的主要来源是空气中
8、的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70的酒精喷雾使空气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟,1、接种室消毒,2、无菌操作要求,操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。,3、材料的切取和接种,4、接种注意事项,每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种,外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜34块，菊的茎或叶68块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件,插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和
9、养分,思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？,答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。,（四）培养,1、愈伤组织的培养,从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养,继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养
10、基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为11.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养,2、愈伤组织的继代培养,在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色,3、试管苗的培养,当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养,（五）移栽,移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日,1、打开封口膜,2、清洗转移,用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间,（六）栽培
11、,3、移栽,珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培,幼苗长壮后，移栽到土壤中,幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花,三、课题延伸,1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养,2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季,课题2 月季的花药培养,一、课题目标： 说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。 二、课题重点和难点： 选取适宜的培养材料和培养基。 三、技能目标： 知道被子植物花粉发育的过程；说出产生花粉植株的两种途径；记住影响花药培养
12、的因素，尝试花药培养的实验操作过程，并进行无菌操作；知道花药培养在育种上的意义。,一、自学导引：,1、基础知识 -被子植物的花粉发育： （1）雄蕊由花丝和花药两部分组成。花药是雄蕊的主要部分，多数被子植物的花药由4个花粉囊组成，花粉囊外由囊壁包围，内生许多花粉粒。当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会形成大量的花粉母细胞（小孢子母细胞）。 （2）花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历四分体时期、单核期和双核期等阶段。,实例一：,关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的 B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果 C
13、、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段 D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央,注：花粉母细胞经减数分裂形成4个单核花粉粒，每个花粉粒的细胞核进行一次有丝分裂形成1个花粉管细胞核和1个生殖细胞核，每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成2个精子。,BD）,基础知识 -产生花粉植株的两种途径,途径一：花粉通过胚状体阶段发育为植株； 途径二：花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。 人工种子是由外植体通过组织培养而获得的胚状体，然后加上人造胚乳，人造种皮而制成；外植体进行的是有丝分裂，无须通过两性生殖细胞结合而发育成的个体，属于无性生殖。,基础知
14、识 -影响花药培养的因素,1、主要的影响因素：材料的选择与培养基的组成。 （1）接种的花药时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧时，花药培养成功率最高。选择完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒；花瓣松动，菌多，消毒困难。 （2）此外，亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度对诱导成功率都有一定的影响。,一、材料的选取 1、选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。 2、确定花粉发育时期最常用方法：醋酸洋红法；焙花青铬矾法。 注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。,实验操作,二、材料的消毒 三、接种和培养 四、结果分析与评价 1、能够通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉。用醋酸洋红法或焙花青铬矾法检测单核靠边期的花粉粒。 2、花药出现污染的原因： （1）消毒不彻底；（2）接种室污染；（3）人为因素的交叉污染等。 3、略。,比较杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种,
