1、掌握培养基配制、培养条件的控制,第四章 植物组织培养的培养条件,知识目标：,能力目标：,会配制培养基,培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。, 营养条件培养基(culture medium),A 概念,B 培养基的种类,培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。 培养基的产生最早是Sac
2、ks(1680)和Knop(1681)，他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基，White培养基在40年代用得较多，现在还常用。而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培
3、养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。,(1)MS培养基 它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。 (2)B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 (3)White培养基 是19
4、43年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MsSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。 （4）N6培养基 是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 (5)KM8P培养基 它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：,C 培养基的成分,培养基的成分主要可以
5、分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。,是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,1 水,2 无机元素(inorganic element),(1)N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3N和NH4N两种形式供应。大多数培养基既含有N03N又含NH4N。NH4N对植物生长较为有利。供应的物质有K
6、NO3、NH4NO3等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 (2)P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。,大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。其作用是：,(3)K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为13mgL为好。制备培养基时，常以KCI、KN03等盐类提供。 (4)Mg
7、、S和Ca、Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO47H20提供。用量为13mgl较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl22H2O提供。,铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 在制做培养基时不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA结合成合物使用。 B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物
8、组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,微量元素： 指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。,3 有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。 常加入的有机成分主要有以下几类：,高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。,1）碳水化合物,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许 多组织很好的生长。,蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗 糖，有时可用2.
9、5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖 对胚状体的发育起重要作用。,不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定 按量称取，不能任意取量。,在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,2）维生素(vitamin),这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢 活动，对生长、分化等有很好的促进作用。,主要有VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc （抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB12等。,一般用量为01
10、10mgL。,3）肌醇 (myoinosltol),在糖类的相互转化中起重要作用。用于构建细胞壁、细胞膜。,使用浓度一般为lOOmgL。,4）氨基酸(almino acide),是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。,培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸。,用量在10-1000mgL之间。,由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要， 以不用为宜。,4 天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,1)椰乳 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一
11、种天然复合物。一般使用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。 2 香蕉 用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200m
12、gL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,5 植物生长调节物(hormone),植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,1）生长素类(auxin),在组织培养
13、中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的 分化和促进细胞分裂、伸长生长。,在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5 10-8rngL)就可促进生长，其次是茎和芽。,天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植 物体内也易受到体内酶的分解。,组织培养中常用人工合成的生长素类物质。,IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培
14、养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,在培养基中添加细胞分裂素有三个作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。 促进细胞分裂与扩大。 抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根
15、培养时使用较少或用量较低。,2）细胞分裂素类 ( cytokinin ),这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非 常昂贵，常用的是6BA。,有20多种，培养基中添加的是GA3。 主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。,GA ( gibberellic acid赤霉素),激素配比模式,高 有利于根的形成和愈伤组织的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化
16、 低 有利于芽的形成,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长 根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的 浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。,在组织培养中一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL， 细胞分裂素0.0510mgL。,生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is comp
17、letely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with r
18、oots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No BAP,BAP reduced to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced de
19、velopment of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the
20、explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,No MS salts No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.
21、,6 培养材料的支持物,琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40C即凝固为固体状凝胶。 琼脂的用量在610gL之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。 一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,琼脂(agar) 在固体培养时琼脂是
22、最好的固化剂。,培养物与培养基的接触(即吸收)面积小， 各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用， 培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生 毒害作用。 市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。,加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优缺点：,优点：,在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，,缺点：,因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。 可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在 滤纸桥上进行愈伤组织培养。,7 抗生物质(antibiotic),抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些
23、植物却不大适应。 在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。 在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。,抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间。,添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快 速繁殖中,对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。,注意：,8 活性炭(active carbon),活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附
24、。 通常使用浓度为0.5l0gL。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛及激素等。,活性炭的应用,茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阈值，一般为0.1%0.2%，不能超过0.2%。 活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的
25、生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。 此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。 活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。,但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质。大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，那种随意抓一撮活性炭放人培养基，会带来不良的
26、后果。因此，在使用时要有其量的意识，使活性炭发挥其积极作用。,D 培养基的制备,所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。 一般母液配成比所需浓度高10-200倍。 母液配制时可分别配成大量元素（浓缩20倍)、微量元素(浓缩200倍）、铁盐（浓缩200倍）、除蔗糖以外的有机物质（浓缩200倍）和激素类（1g/L）等5种。,一、母液(stock solution)的配制和保存,1 什么是母液？,配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。 药品的称量及定容都要准确。 各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合
27、。 母液配好后都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。铁盐贮备液必须贮存于棕色玻璃瓶中。 母液在使用之前必须轻轻摇动瓶子，如发现其中有沉淀悬浮物或微生物污染，必须立即将其淘汰。,2 母液配制的注意事项：,生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。2，4D可用O1molL的NaOH或KOH助溶，加入温水定容。生长素常配成1mgml的溶液贮于冰箱中备用。 细胞分裂素类一般先用少量1N盐配溶解后，再加入温水冷却后定容，贮于冰箱中备用。 铁盐配法（MS为例）：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边
28、慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于棕色瓶冰箱中备用。,二、 母液的配制方法,将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。 一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。,2 注意事项：,1单配法：,三、培养基配制程序,水,药品,糖,琼脂,水,玻璃器皿及其他准备,+,+,+,加热融化,混匀,混合,调节PH值,定容,分装,灭菌,冷却,接种,称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水直到培养基最终容积的3/4，加热使之溶解。在配制液体培养基时则无需加热。 分别加入一定量的各种贮备液，包括生长调节剂和其他的特殊加物。 加蒸馏水直至培养基的最终容积。 充分混合
29、后，用0.1mol/L的氢氧化钠或盐酸调节培养基的pH值（6.0） 。 把培养基分装到所选用的培养容器中，每个150毫升的三角瓶约装50毫升。 用适宜的塞或盖封严瓶口。 灭菌。 使培养基在室温下冷却，置冰箱中在4下保存。做上标记。 灭菌后的培养基最好在短期内使用，临时可在黑暗条件下低温保存。一般不宜重复消毒。,移液器,四、 常用设备,移液管,电子天平,酸度计,酸度计简称pH计，由电极和电计两部分组成。,电炉,E 培养基的选择,在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性
30、和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。 常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。,一、单因子试验,在单因子试验中由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。 生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块
31、或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。 试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有410瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。,2种激素5种浓度的实验组合,对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mgL)，
32、这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见表33。,二、多因子试验,三、逐步添加和逐步排除的试验方法,在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。 在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。 在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。,四、广谱实验法,在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。 对每一类物
33、质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。 在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。 达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。, 环境条件,在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件； 培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。,1 温度(temperature),温度不仅影响植物
34、组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。 不同植物培养的适温不同. 不同培养目标采用的培养温度也不同. 大多数植物组织培养都是在2327之间进行，一般采用25 2。,2 光照(light),一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 离体培养中一般光量在2000-3000lx。,组培中光照是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及 光照时间方面：,1）光照强度(light intensity),2）光质(light wave),光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 对苗再生最有利的光谱是蓝光区，根的发生则是红光区。
35、,3）光周期(light period),试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，一般每天光照12-16小时。,3 湿度 (humidity),容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压
36、的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。,湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件,4 渗透压(penetrating pressure),培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，影响到渗透压的变化。 培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。,5 pH值 (pH value),不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表21)，大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8. pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说当pH值高于65时，培养
37、基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。 高温灭菌会降低pH值(约0.20.3个pH值)，因此在配制时常提高pH值0203单位。 pH值大小调整可用01M的NaOH和0IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高02单位，lml的HCl可使pH值降低02单位。调节时一定要充分搅拌均匀。,不同植物的最适pH值,6 氧气(oxygen),氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。 固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振
38、荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等,练习：,培养基一般包括哪些基本成分？起作用是什么？ 培养基的配制步骤及注意事项？ 用于植物组织培养的植物生长调节物质主要有哪两种？他们在组培中各起什么作用？ 接种后的离体培养物对光、温度、湿度等有何具体要求？如何调控？,第五章 组培苗的培养、试管苗的驯化与移栽,指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,培养,一、培养方法,(1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生
39、。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100rmin，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。,简单，一般只要有培养室及接种箱即可。,优点：,固体培养,定义：,指在培养液中加入一定的凝固剂，使培养液固化， 然后将外植体直接介入此培养液中的培养,适用范围：,一般用于组织块、愈伤组织、短枝或茎尖等材料 的培养,外植体只有底部表面能接触培养基，造成细胞各部分营养浓度差异。 外植体插入培养基后，气体交换不畅及排 泄物质积累
40、，影响组织吸收养分和造成毒害。 组织受光不均匀，细胞群生长不一致。,缺点：,液体培养,在培养液中直接接入培养物的培养。,定义：,适用范围：,一般用于细胞、原生质体的培养，也可用于愈伤 组织、胚状体等材料的继代培养。,常见类型：,液体静置培养,液体振荡培养,液体静置培养,把培养物接入培养液中静置于培养室或 光照培养箱中的培养。,定义：,优点：,培养液中不会出现营养物质浓度差异的现象，用来进行营养方面的研究。,具体做法：,试管中先放入培养液，然后放入滤纸，滤纸制成桥状的支持物，使它正巧贴在液面上，最后把组织放在滤纸上。滤纸像灯芯一样不断给组织提供水分和养料。,液体振荡培养,把培养物接入培养液中，连
41、同三角瓶放在振荡器（摇床或转床）中振荡培养的方法。,定义：,优点：,既可保证营养液的充分混合，又保证了组织块呼吸 所需的气体交换。,二、培养步骤,初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等,1.初代培养,2. 继代培养,在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能
42、达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。 继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS0基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小，可先切成芽丛小块，放人MS0培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。,增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖； 在快速繁
43、殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。, 试管苗的驯化,试管苗生长细弱，茎、叶表面角质层不发达； 试管苗茎、叶虽呈绿色，但叶绿体的光合作用差； 试管苗的叶片气孔数目少，活性差； 试管苗根的吸收功能弱； 对逆境的适应和抵抗能力差。,一、试管苗的特点：,二、试管苗的驯化,驯化的目的：,提高试管苗对外界环境条件的适应性，提高其光合作用的能力， 促使试管苗健壮，最终达到提高试管苗的移栽成活率。,驯化的原则：,应从温度、湿度、光照、及有无菌态等环
44、境要素进行，驯化开始 数天内，应和培养时的环境条件相似；驯化后期，则要与预计的 栽培条件相似，从而达到逐步 适应的目的。,驯化的方法：,首先进行练苗，即将长有完整试管苗的培养瓶由培养室转移到半遮 荫的自然光下进行锻炼23d ，在自然光下恢复植物体内叶绿体的 光合能力和健壮度，然后打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐减低 温度，转向有菌。驯化一般进行1-2周。,1 移栽用基质,适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土
45、比例为1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1:1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。 (1)河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为12mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.10.2mm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。, 试管苗的移栽,(2)草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂
46、等种类相互混合配成盆土而加以使用。 (3)腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。,2 移栽和幼苗的管理,从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。然后移栽到无菌的基质中。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤
47、，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。,当长出2-3片新叶时，就可将其移栽到田间或盆钵中。,(1)保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当57d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给
48、予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。 (2)防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度8001000倍，喷药宜7l0d一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0.1%的尿素，或用12MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。,(3)一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18200C，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗
49、生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。 (4)保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。 综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。,总结：植物组织培养的基本步骤,1 无菌外植体的获得,外植体的消毒,外植体的选择,2 初代培养物的建立,无菌环境的获得,规范的接种操作,提供适宜的外植体培养条件,3 形态发生和植株再生,建立的无菌培养物在适宜的离体环境中生长发育（形态发生），形成完整的小植株（植株再生）。,外植体形态发生的途径,外植体,愈伤组织,体细胞胚,器官分化,小植株,小植株,脱分化,再分化,4 培养产物的观察记载,见教材63页,5 试管苗移栽驯化,练习：,在植物组织培养中，通过哪些途径可以得到完整的植株
