1、1.2 基因工程的基本操作程序 原理技术应用,北京理工大学附属中学 苏明学,重组人胰岛素 （Humulin优泌林）,1982年10月全球第一个商业化基因重组人类胰岛素在美国上市,思考1： 如何利用大肠杆菌来生产重组人胰岛素？,基因组文库的构建基因的分离与克隆,思考2：如何从人类基因组中分离胰岛素基因？,思考3：从基因组文库中获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？,cDNA文库的构建,思考4：能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？,聚合酶链式反应（PCR）,思考5：如何快速扩增胰岛素基因（cDNA）？,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成
2、为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,思考6：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？,氨基酸序列mRNA序列DNA序列人工合成,DNA合成仪,思考7：选用哪种限制酶对质粒和胰岛素基因进行酶切，可将目的基因插入到Tetr基因内？,思考8：重组质粒导入大肠杆菌后能表达吗？若不能， 还应做怎样修饰？,用BamH对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？,思考9：如何根据标记基因筛选到含重组质粒的大肠杆菌？,应将体外重组反应混合物转化给 AmpsTets/AmprTetr大肠杆菌菌株？ 将
3、Amp琼脂平板上的菌落原位影印在Tet平板上生长，对比这两个平板上的菌落生长情况，如何挑出含有重组质粒的菌落？,定向克隆策略双酶切连接,思考10：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？,大肠杆菌合成的胰岛素具有生物活性吗？,如何鉴定胰岛素基因在大肠杆菌中是否得到了成功表达？,酵母菌,若通过基因工程生产干扰素（一种糖蛋白），应选择 (大肠杆菌/酵母菌)作为受体细胞？说明理由。,若要培育转基因抗虫棉，目的基因和受体细胞分别是什么？如何将目的基因导入受体细胞？,如何鉴定棉花的染色体DNA上是否插入了抗虫基因？,目的基因成功表达的标志是什么？,如何用基因探针检测目的基因是否转录出了mRNA？,如何检测B
4、t基因是否成功地翻译成Bt毒蛋白？,将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质； 将表达出的蛋白质注射给动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体； 从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上； 将抗体与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,蛋白质检测,蛋白质检测： 利用抗原-抗体杂交： 被检测物是蛋白质， “探针”是抗体,目的基因的检测与鉴定,存在与否,分子水平检测,个体水平鉴定,分子杂交技术,抗原-抗体杂交,：检测性状及产品活性等,表达与否,mRNA,蛋白质,：DNA,若要培育转基因羊，从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。 人tPA基因为什么要和羊泌乳基因重组在一起？ 为什么选
5、择受精卵作为受体细胞？ 怎样将重组tPA基因导入受精卵中？,（07天津卷）下图为获得转基因抗虫棉的技术流程。请据图回答： （1）A过程需要的酶有_。 （2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是_。,（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入_。 （4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用_作为探针。,(12年海淀区期中) 大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入_物质。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成_颜色的菌落，原因 。,
