1、第三章 基因工程载体,基因克隆载体,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。 基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。,载体的功能及特征,一、发展概况 1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.
2、第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 克隆载体必须是安全的。,第一节 质粒克隆载体,一、 质粒的一般生物学特性,发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母
3、 独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。,一、质粒的一般生物学特性,质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子 在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。 在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。 质粒DNA分子大小1-100Kb以上。,质粒DNA的复制,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯
4、双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 数个 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,质粒的不亲和性,有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在
5、细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒迁移,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由
6、bom 和mob 基因决定,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒载体,二、构建质粒克隆载体的基本策略,1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。 2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。,
7、三、质粒克隆载体的构建,质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。,大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建,pBR322的构建是质粒载体构建的一个典范。 pBR322的亲本质粒 pSF2124，含有Amp抗性基因 pMB1，含有松弛型ColE1的复制起点（ori） Psc101，含有Tet抗性基因,大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建,1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质
8、粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的质粒pMB3(13.3Kb)。pMB3 AATT黏性末端环化 导入大肠杆菌 pMB8(2.6Kb),EcoRI*,2、从质粒pSC101获得四环素抗性基因（Tetr)。 获得pMB9（5.3Kb),3、向pMB9引入Amp抗性基因。 pSF2124的Tn3体内易位至pMB9获得pBR312 (10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因） pBR312 pBR313 (8.8Kb，除去 Amp抗性基因中的BamHI位点）,EcoRI*,4、,pBR313,pBR322(4.3Kb),pBR320(2.
9、8Kb),pBR318（6.3Kb),去除两个PstI,EcoRII片断去掉,酶切,酶切,体外重组,四、常用质粒载体类型,1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿梭质粒载体,1、克隆质粒载体,克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。 pBR322质粒 pUC系列的质粒载体,pBR322质粒,具有较小的分子量，大小4363bp 可以克隆大到6Kb的外源DNA片断 具有两种选择标记，即Ampr和Tetr。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 Amp抗性基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，Tet抗性基因可被BamH I, Hind III
10、切开，通过插入失活筛选重组子。 在宿主细胞内具有较高的拷贝数。 一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。,CAP protein binding site - 591-554 (compl. strand); mRNA (LacZ) starts at nt position 507 (compl. strand); lac repressor binding site - 507-487 (compl. strand).,pBR322插入失活效应,筛选重组子的示意图,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,pUC系列的质粒载体,pBR3
11、22质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因 位于lacZ基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能,Multiple Cloning Sites pUC18,pUC19,pUC系列质粒载体的优点,具有更小的分子量和更高的拷贝数 pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失 适用于组织化学方法检测重组体
12、 LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做互补。 具有多克隆位点MCS区 pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点 具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,利用菌落颜色筛选重组子,2、表达质粒载体,是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋
13、白质的质粒载体 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体,表达载体与克隆载体的区别,强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性,表达型载体（expression vector）,特点 基因的启动子序列和终止子序列 一般无检测标记基因 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） 重组分子用凝胶电泳检出（
14、依赖于分子量差异）。 结构 转化单元-宿主细胞转化 表达单元-外源基因表达,表达型载体（expression vector）,类型型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）,三种表达型载体结构图,表达型载体（expression vector）,显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。 用途 表达外源基因以产生大量外源基因产物 用于构建cDNA文库
15、,3、多功能质粒载体,载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。 pGEM 系列质粒载体就是一类多功能载体，如： pGEM-3、 pGEM-4、 pGEM-3Z、 pGEM4Z 、pSP64、 pSP65、 pGEM3Zf。,pGEM系列载体,pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。 在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。 此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。,pGEM3Z载体,pGEM3Z与pUC载体非常相似 ，其不
16、同点： pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。 这两段启动子（噬菌体SP6T7)存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。 合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,Pgem-3E,PSP6,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,1、克隆载体，全长3.19kb，具有Amp抗性基因和复制起始点
17、 2、MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子-可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点 3、MCS为于lacZ基因内部（插入失活）蓝白斑筛选 4、引入丝状噬菌体f1(+) 复制起始点-可以产生单链DNA，并分泌至上清中，,分泌型融合表达载体，有两个启动子（Plac,Pspa），启动子下游装有SPA的信号肽序列和两个结构基因ZZ。产生与SPA蛋白ZZ段融合的蛋白，并可将融合蛋白分泌出胞 4.59kb，含Amp抗性基因和原核复制起始点 有f1复制起始点，可产生单链DNA,4、穿梭质粒载体,是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载
18、体。 特点：质粒载体可以携带外源DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核之间往返穿梭。 常见的穿梭质粒载体：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等。,穿梭质粒,能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究,第二节 噬菌体载体,一、 噬菌体的生物学特性,噬菌体的生活周期 噬菌体的基因组结构和功能 噬菌体的DNA复制,1、噬菌体的生活周期,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬菌体由外壳包装蛋
19、白和l-DNA组成,2、噬菌体的基因组结构和功能,l-DNA全长48502个核苷酸 l-DNA上至少有61个基因 线状ds-DNA，两端具有12bp 5-突起（5-GGGCGGCGACCT-3）该末端称为cos位点，可被编码的末端酶所识别,2、噬菌体的基因组结构和功能,人为将噬菌体基因组分为3个区域： 左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。 中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和一整合切割基因。 右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。,3、噬菌
20、体的DNA复制,裂解周期 早期：环状的DNA分子按型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。 晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从型转变为滚环型复制，合成出一系列DNA线性排列的多聚体分子。 cos位点是噬菌体正确包装的必需位点。,3、噬菌体的DNA复制,溶原性周期 DNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。 cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。 附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。 原噬菌体的删除作用 整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到
21、大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。,二、 噬菌体载体的构建,（一）构建噬菌体载体的基本原理 （二）构建噬菌体载体的基本内容 1、除去多余的限制酶识别位点 2、切除掉DNA的非必需区 3、引入适当的选择标记 4、引入无义突变,（一）构建噬菌体载体的基本原理,野生型的噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因 DNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入体内突变和建立新的克隆位点。 噬菌体头部只能容纳自身
22、DNA的75-105%，即39-52.5 Kb，天然仅可插入2.5Kb外源DNA片段除去所有与裂解无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。,（二）构建噬菌体载体的基本内容,1、除去多余的限制酶识别位点 天然的-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。 一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的品系。 自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的 DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。,通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的-噬菌体,（二）构建噬菌体载体的基本内容,
23、插入型载体 只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的噬菌体派生载体 承载10Kb以内外源DNA片断 取代型载体 具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可被外源DNA片断取代 承载20Kb左右外源DNA片断 有多克隆位点，即可用作插入型又可用作取代型,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0 - 14 kb,（51 37）,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,l-DNA载
24、体的构建：缩短长度 取代型载体,（二）构建噬菌体载体的基本内容,2、切除掉DNA的非必需区 载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。 不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去,（二）构建噬菌体载体的基本内容,3、引入适当的选择标记 通过组织化学方法进行重组子的筛选 加装选择
25、标记 lacZ 不同的噬菌斑形态可作为筛选重组子的标记 imm434基因编码一种阻止 -噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑,（二）构建噬菌体载体的基本内容,4、引入无义突变 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌
26、菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,三、常用的噬菌体载体,插入灭活型载体 Charon2、Charon6、lgt11 取代型载体 lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40 正选择型载体 lEMBL1、lL47、l1059 野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并
27、形成透明斑,第三节 单链DNA噬菌体载体,优越性 能克隆较大的DNA片断，包装M13DNA的6倍 产生大量含有外源DNA序列的单链DNA分子 测定外源DNA片断的插入方向 可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA 两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑,一、M13噬菌体的生物学特性,（一）M13噬菌体的基因组结构 （二）M13噬菌体感染、复制及包装,（一）M13噬菌体的基因组结构,基因、和编码特异性蛋白质，参与病毒颗粒的组装 基因参与DNA复制 基因、和编码M13的结构蛋白 基因参与单链复制过程中的环化作用 基因是衣壳蛋白的重要组成部分,III VI I IV II X V
28、VII IX VIII,野生型M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp系列载体,lacZ,polylinker,（二）M13噬菌体感染、复制及包装,复制过程： ss（+） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min)DNA包装无严格限制,（+）DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,- DNA,II,V,感染周期,二、M13噬菌体载体的构建,M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ基因，产生了M13m
29、p1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。 M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。 M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。,Coordinates
30、 of M13mp18/19 genes (termination codons included): I 3196-4242 II 6849-831 III 1579-2853 IV 4220-5500 V 843-1106 VI 2856-3194 VII 1108-1209 VIII 1301-1522 IX 1206-1304 X 496-831,M13mp18,M13mp19,三、 M13噬菌体载体的主要功能,最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途： （1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序 （2）用于单链DNA的定点诱变 （3）用于合成探针,四、噬菌粒（Phagem
31、id）载体,质粒与M13-DNA的重组体 带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样更于筛选及克隆 由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及-DNA。,第四节 粘粒载体（cos质粒载体）,第四节 粘粒载体（cos质粒载体）,l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA 考斯质粒是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体,第四节 粘粒载体（cos质粒载体）,能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞
32、能像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 不能体内包装，不裂解受体细胞,第五节 其他载体,一、人工染色体 二、植物基因工程载体 三、动物基因工程载体,酵母人工染色体,酵母菌人工染色体,YAC可接受100-1000 kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具,酵母菌人工染色体,YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为100 - 2000 kb,pYAC4,C
33、EN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵母染色体,细菌人工染色体,很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体(BAC)载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间,载体容量,M13mp载体 4 kb细菌质粒载体 10kb 载体 23kbcos质粒载体 48kb P1载体 95 kbpYAC载体 1000 kb,Plant cloning vectors,Ti质粒:
34、侵染广泛的双子叶植物 T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置,Ti质粒及其衍生载体,Ti质粒包括五个区域 1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中
35、 2.质粒转移区(PT) 3.冠瘿碱代谢区 4.复制原点 5.毒性区,Ti质粒及其衍生载体,T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。,Ti质粒及其衍生载体,Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体： （1）双元载体(binary vectors
36、） 如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(Aph)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-Npt)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及-互补显色标记 （2）共整合载体(integrated vectors),CaMV克隆载体,含1个约8kb的环状双链DNA分子； 用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移； 其感染对植物有害，不能直接做载体； CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。,Cloning vectors of animal cell,动物病毒：猿猴
37、病毒-40(SV-40)的衍生物5243 bp共价闭合环状分子感染率高，几乎100寄主细胞能被感染能提供完整的真核基因转录所需的成分 侵染性具有寄主特异性 改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的DNA分子 其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原用家蚕的核多角体病毒表达人-干扰素,反转录病毒克隆载体,反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。 只要将外源目的基因组入原病毒DNA的合适克隆位点，就能在感染的动物细胞中表达。,分子克隆载体的选择,选择克隆载体的几个重要参数 （1）实验对象
38、 （2）实验性质 （3）载体容量 （4）合适克隆位点 （5）载体的稳定性 （6）载体DNA制备的难易 （7）外源基因表达产物产量、产物特点等,实验对象,（1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。 （2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。,实验对象,如常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如： E.coli DH5、 E.coli DH5、
39、 E .coliDH5F 1） 三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组 2） DH5和 DH5F都具有一个可供遗传标记lacZ检测的遗传背景 3） DH5F可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F的存在,1当一DNA片段插入终止子探针型载体pBU10的Hind克隆位点后，重组质粒仍可转化E.coli (CmlsTcs) 为CmlrTcr ，为什么? 可设计什么实验证明其假设?2当一DNA片段插入pUC18后，在x-gal平板上出现两类菌落，兰色菌落和白色菌落。从白色菌落中分离纯化的质粒经电泳检查，均比原载体DNA分子大；但从兰色菌落随机分离的质粒D
40、NA却有两类，其中一类与载体大小相同，另一类却与白色菌落中分离的质粒大小相同。如何解释这一实验结果? 可设计何种实验证明你的解释是正确的? 3当把一外源DNA插入一克隆载体后，重组DNA分子转化E.coli 细胞所获得的重组子分子可根据其限制酶图谱分为两类，即这两类转化子中所含的重组DNA分子的限制酶图谱不一样，从这两类转化细胞中分离到的重组DNA分子可用限制酶回收插入的片段。而从这两类转化细胞培养液所分离到的DNA却,不能用限制酶回收该片段。当把同类转化细胞培养液所分离到的DNA进行复性分析时，DNA分子间不会发生复性，但把从不同类转化细胞培养液分离到的DNA进行同样的实验时，发现在电镜下可
41、观察到十分类似于8字形的结构。如何解释上述实验结果? 可利用图示法解释。 4. 由于分子克隆载体的大小决定外源DNA插入片段的大小，两者呈反比关系，因而在建立载体时千方百计地减小载体分子量。对于穿梭载体，因为复制起点和标记基因具有生物特异性，所以载体上需要同时具有两个以上的复制起点和标记基因。已知不同生物的某些基因启动子可以在E.coli细胞中启动基因转录，问可以采取一些什么方法减小穿梭载体的分子量?,实验性质,分子克隆的一般程序包括以下几步： （1）分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA（2）构建基因文库或cDNA文库（3）目的基因或cDNA 克隆的筛选（4）目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等（5）基因表达与调控机理的研究,
