1、1,第二节 病毒载体 virus vector,什么是病毒? 病毒：由DNA（或RNA）和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。,1/31,2,噬菌体的溶原性周期和溶菌性周期,天然的转基因过程,2/31,3,1. 噬菌体克隆载体, 噬菌体（Bacteriophage lambda）,3/31,4,（1）DNA： 线状，双链DNA， 48502bp （linear，double-stranded DNA，dsDNA） cos位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。,1.1、 噬菌体的性质,4/31,5,宿主细胞,头部,尾部,尾丝,DNA,5/31,6,6/31
2、,7,（2）DNA 有56个限制酶识别序列，50个基因， 左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。,左臂 left arm,右 臂 right arm,中央片段 central stuffer,7/31,8,(3)、 噬菌体的侵染,8/31,9,1.2、噬菌体载体的构建,（1）切去DNA的中央片段,BamHI sites,Left arm,Right arm,COS,COS,BamHI,COS,COS,L,R,COS,COS,L,R,回收,9/31,10,（2）插入标记基因（marker gene） 例如：lacZ 基因，转化的菌斑在含有X-gal的培养基因上表现篮色.,10/31,11,（
3、3）插入外源基因（foreign gene） 可插入20kb的目的基因。,11/31,12,12/31,13,（4）建立DNA体外包装系统（packing system） 包装后方可侵染.,13/31,14,重组的噬菌体,体外包装,14/31,15,2、 柯斯质粒载体（Cosmid vector）,2.1 含义：含有噬菌体粘性末端（cos位点）的质粒，又称粘粒 2.2 特点： 带有cos 位点 4-6kb 有标记基因 常用于构建cDNA文库（cDNA library） 可携带大的基因片段，45kb。 2.3 构建过程,15/31,16,体外包装,16/31,17,第三节、染色体定位整合载体,基
4、因整合平台系统：包括整合平台和定位整合克隆载体。 整合平台：受体细胞基因组上给定的一个DNA区域，是外源DNA定位整合的位置。 定位整合克隆载体：质粒克隆载体，有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。,17/31,18,一、定位整合模式,Foreign DNA,Homologous sequence,Vector DNA,Genome DNA of receptor cell,Genome DNA of receptor cell,Homologous sequence,Vector DNA,18/31,19,与受体细胞和同源序列长短有关，一般较低 (10-7-10-3 ). 会出现
5、随机插入，筛选困难。,二、定位整合效率,19/31,20,1 定义 酵母人工染色体：具有酵母染色体的着丝粒（cen4）、自主复制序列(ARS1)和端粒等功能序列的质粒载体。 可容纳1000至3000kb的DNA大片段。,第四节 YAC克隆载体,20/31,21,是Yeast和E.coli.的穿梭载体(shuttle vector) YAC在E.coli.中按质粒形式复制，转入酵母菌后按染色体形式复制。 穿梭载体:含有不止一个复制起始位点、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体,21/31,22,23,外源基因,EcoRI,23/31,YAC克隆载体的构建,24,2 应用 2.1 构建基因
6、组文库（ genome library）： 特别适于动植物等基因组较大的生物。 2.2、基因治疗(Gene therapy)： 可复制，安全,24/31,25,一、启动子探针型载体 质粒载体，含有一个检测部件（一个无转录功能的标记基因和克隆位点）,第五节、特殊用途的载体,25/31,26,The gene which can not express,GFP gene,Multiple cloning sites,AMP,r,26/31,27,二、诱导型表达载体： 启动子在特殊的诱导条件下才有转录活性。 外源基因处于这样的启动子下，必须有诱导条件才能表达。 优点：易于人的控制，安全，可用于基因治
7、疗。,27/31,28,三、组织特异性表达载体 只能在特定组织中表达的载体。 乳腺组织特异性表达载体：利用牛、羊等动物的乳腺产生药物。 肿瘤细胞特异性表达载体：基因治疗药物的定向导入。,28/31,29,四、分泌型表达载体 基因表达的蛋白可分泌到胞外，利于产物分离纯化。,29/31,30,本章主要内容小结： 常用质粒载体、Ti质粒载体。 病毒载体 染色体定位整合载体 酵母人工染色体载体 特殊用途的克隆载体 上述载体的结构特点及构建方法及原理。,课后到“生物工程学院网站主页”中精品课程中的基因工程原理网络课程中复习,30/31,31,复习题 什么是质粒，质粒载体，如何构建质粒载体? Ti质粒载体的构建方法及其步骤？ 噬菌体载体的构建步骤? 染色体定位整合载体的原理？,31/31,
