1、体外三维细胞培养术在组织工程中的运用杨清松 生命科学与生物制药学院0909501162 生物制药 09摘 要： 本文主要介绍了体外三维细胞培养术的三大基础原件细胞、支持材料、培养基，及目前该技术在皮肤组织工程、血管组织工程、骨组织工程中的主要运用。关键词：三维细胞培养术；组织工程；应用Application of Three-Dimensional Cell Culture in Tissue EngineeringAbstract: This paper mainly introduced three basic elements of Three-Dimensional Cell Cult
2、urecells, support materials, culture medium. Also the application of Three-Dimensional Cell Culture in Bone Tissue Engineering, Skin Tissue Engineering and Vessel Tissue Engineering are introduced detailedly.Keywords: Three-Dimensional Cell Culture ；Tissue Engineering；Application1 引言组织工程学是20 世纪80 年代
3、末期发展起来的一门新兴边缘学科 1。组织工程是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门科学。组织工程的三要素为细胞、支架、生长信息，其核心目的在于使细胞按既定的设计生成具有特定的生物学功能的组织 2。不同于传统的二维化单层细胞培养, 三维细胞培养技术( three-dimensional cell culture, TDCC) 是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长, 构成三维的细胞2载体复合物。2 基础介绍2.1 细胞细胞是体外构建工程组织、
4、器官最为重要的材料。从组织工程学的应用角度出发考虑,用于体外构建工程组织、器官的细胞需满足以下三个基本前提: (1) 具有特定的分化表型或定向分化潜能 3; (2)可靠的细胞来源; (3) 不引发移植排斥反应。目前用于体外构建工程组织、器官的细胞按其来源分为自体细胞、同种异体细胞和异种细胞三类。这三类细胞均不能同时满足上述的三个基本要求。其中自体细胞存在来源严重短缺的限制;异种细胞存在移植排斥反应、传染动物源性病毒和伦理的制约; 同种异体细胞同时存在着来源受限和移植排斥反应的问题。2.2 支持材料生物材料在组织工程中起着替代细胞外基质或组织、器官的基质的作用。其主要功能包括以下两点:其一,为体
5、外构建工程组织或器官提供三维的细胞生长支架,使细胞间形成适宜的空间分布和细胞联系;其二,提供特殊的生长和分化信号,诱导细胞的定向分化和维持细胞分化 4 。随着对材料- 生物体相互作用机理研究的深入,对生物材料的要求,已从包括机械强度、亲水性、可降解性和易加工程度等理化性能和生物相容性的基本要求,发展到对生物材料的形状结构进行精密的设计和加工及对生物材料表面的改造和修饰,赋予生物材料特定的生物活性和功能。三维骨架由基质材料构建,主要作用是提供物理强度和张力,理想的基质材料应具备以下特点: (1) 良好的组织兼容性及生物可降解性; (2) 良好的细胞界面,利于细胞黏附、增殖及分泌细胞外基质; (3
6、) 具有三维空间结构,有利于营养物质和代谢产物的交换; (4) 具有一定的强度和可塑性。三维骨架结构除了提供足够的机械强度外,还必须为种子细胞提供三维空间结构.生物材料的三维结构可在三个尺度水平上控制工程组织、器官的生长发育过程: (1) 在cm - mm级水平决定工程组织的形状和大小; (2) 在m 级水平通过生物材料的空隙大小和形态结构调节细胞的迁移和生长; (3) 在nm 级水平通过生物材料的表面化学性质调节与其接触的细胞的粘附和基因表达。2.3 培养基培养基是细胞三维培养中对细胞分化起着关键性作用, 但尚未引起足够重视的环境因素 5 。迄今为止, 商品化的细胞培养基是为支持细胞的体外增
7、殖而设计的。由于细胞在体外增殖的同时往往伴随着不同程度的去分化而失去某些分化表型,以体外构建组织、器官为目的的细胞三维培养一般需经历细胞增殖、细胞分化和组织或器官型形成三个阶段。细胞体外培养常规使用的细胞培养基、生长因子或胎牛血清完全适用于细胞三维培养的细胞增殖阶段。在细胞分化阶段应尽可能减少生长因子和或胎牛血清的用量, 减少培养环境的促细胞有丝分裂压力。商品化的细胞培养基的电解质成分与动物或人血清的电解质成分不相同,培养基中Na + 浓度较高而 K+ 浓度较低。提高培养基中的Na + 浓度和/ 或降低培养基K+ 浓度,均能促进细胞增值,降低培养基中的Na + 浓度和/ 或提高其K+ 浓度,有
8、利于细胞分化的诱导和维持。调整或重新设计用于细胞三维培养的培养基电解质组成、设计含有适宜的分化因子和/ 或激素的无血清培养基,有助于控制细胞的去分化和诱导细胞的定向分化。3 三维细胞培养技术主要应用3.1 软骨组织工程采用密度梯度离心法加贴壁培养方法得到的MSCs具较高的纯度 6,且体外培养具有较强的增殖能力,短时间内可大量扩增,达到组织工程需要的种子细胞数量要求,且细胞保持未分化状态,具有良好的生物安全性。经过三维培养后能表达型胶原和蛋白多糖等椎间盘细胞外基质,因此MSCs 是椎间盘组织工程理想的种子细胞。为探讨通过MSCs 组织工程学方法修复退变椎间盘提供了实验基础。软骨细胞的表型特征体现
9、为型胶原和聚集素(aggrecan) 等软骨特异性基质的合成、沉积与维持。体外单层培养的软骨细胞将逐渐发生退化,形态上转变为扁平、梭形的成纤维细胞样外观。而型胶原和软骨白合成的降低则说明了其生化和遗传特性的改变。其原因可能是体外培养时与体内条件迥异的力学、营养微环境和受其影响的细胞间及细胞- 基质间的相互作用。这种退化现象将限制工程化软骨的获得。研究者已经尝试了多种方法以克服此障碍: (1) 选择合适的细胞接种密度。Panossian 等 7 比较了不同来源的软骨细胞、不同的细胞密度与培养时间对于软骨生长的影响。认为细胞种植密度为40 106/ mL 时,耳和关节软骨细胞均可生成合适的新生软骨
10、组织。将经过14 代的单层细胞培养(密度2 106/ mL) 后的退化软骨细胞引入高密度培养系统(密度2 106/L) ,可使其重新获得软骨细胞表型,分泌软骨细胞特异性基质。其机制可能是高密度培养条件推动了软骨标志物基因- Sox9 基因的表达,以及特异性受体(如整合素受体3) 的出现,从而促进了细胞基质间的相互作用。 (2) 构建合适的培养体系。将利于细胞扩增的单层培养体系与可以有效保持软骨细胞表型的三维培养系统联合运用,并在三维培养中选择合适的支架。此外还可以运用微载体培养技术推动退化软骨细胞的再分化。(3) 应用合适的生长因子。包括bFGF、PDGF 、 IGF - 1 在内的生长因子有
11、维持软骨细胞表型、促使退化软骨细胞重新表达软骨细胞表型的能力。3.2 皮肤组织工程研究皮肤组织工程学是应用组织工程学的方法, 先在体外培养高浓度的角阮细胞, 并转种在细胞外基质构成的三维支架上培养扩增, 将这种角阮细胞-ECM生物复合体种植于创面,ECM可被人体逐步降解吸收, 角肮细胞继续增殖, 达到修复创面, 重建功能的目的 8。细胞悬液：5xDMEM：胶原溶液按1:2:7的容积比例，置冰上充分混匀，用0.1mol/L的氢氧化钠中和至pH值为中性。取1mL加入35mm培养皿中，37度培养箱中放置10min ，混悬液便形成凝胶固定于培养皿中。加入适量的完全培养基，于培养箱中孵育培养。并用纤维细
12、胞胶原网架的制作方法得到皮肤组织工程用组织。单纯应用培养的角阮细胞因无真皮而挛缩, 故基质三维支架是皮肤组织工程的必要成分。基质三维支架, 既是培养角肮细胞的附着场所, 又是良好的创面覆盖物, 要求理化性能好, 能被降解吸收, 隔离病菌, 防止水分丢失, 便于手术应用, 无抗原性, 价格低廉, 柔韧耐用, 生产制备方便, 易消毒、贮存。因此基质的研究开发一直是细胞培养的重要方面 9。3.3 血管组织工程动脉缺血性疾病以动脉硬化性血管疾病为主要代表,是当今世界人群死亡的重要病因 10。目前主要的治疗方式为动脉旁路术,移植材料有自体血管和人工血管。由于可利用的自身血管来源有限,而人工血管(特别是直
13、径 4 6 mm) 的远期通畅率不够理想 ,因而寻找新的治疗方法和移植材料成为重要的研究课题,由此引发血管组织工程学研究。细胞三维培养物的血管形成细胞三维培养所形成的人工组织样或器官样结构需达到一定的大小才有实际应用价值, 某些工程组织或器官的表型与其大小紧密相关。肝细胞的三维培养物所能表达的蛋白质的种类和水平随其大小呈正相关。一般情况下细胞三维培养形成直径大于1 mm 的球形结构时, 由于受营养物质传递和氧扩散的限制, 位于中心的细胞易于发生坏死。因此, 细胞三维培养要求培养体系中的所有细胞均能得到充足的营养和氧的供给。诱导细胞三维培养物的血管形成可有效地克服因传质传递受限所致的细胞坏死 1
14、1。实验证明:将具有刺激血管形成的可溶性信号因子,如碱性成纤维细胞因子、血管内皮细胞生长因子等固定于生物材料支架,能触发细胞三维培养物的血管形成。进一步的研究应确定血管生成因子的释放方式及对其活性实施有效控制的方式,使细胞三维培养物的血管形成能根据细胞三维培养物生长的需要在特定的时间和位置形成血管。4 展望目前以实现生物医药规模化生产为目的的大规模动物细胞培养技术虽已取得了显著的发展,但以体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物为主要目的的细胞三维培养技术尚处于不成熟的早期发展阶段,诸如起细胞外基质和/ 或生物支架作用的人造生物材料、培养基、培养装置、不同类型细胞的共同培养和细
15、胞三维培养物的血管形成等问题均有待进一步研究解决。随着科学技术的不断进步，细胞三维培养在组织工程中的应用必将带来医学变革，并为造福人类作出巨大贡献。参考文献（References ）1 Xiangping Meng, Yan Gao. Electric Systems Analysis M. Beijing: Higher Education Press, 2004. 3-21.2 盛治国.体外细胞三维培养技术在药理毒理学研究中的应用，中国药理学与毒理学杂志，2007 年 10 月;21 (5) : 444 4483 Nerem RM_Sambanis A. Tissue engineerni
16、ng .1995 , l :34 Minuth WW.Sittinger M.Kloth S. Cell Tissue Res 1998 .2915 Freed L E.Vunjak 一 Novakovic G. In Vitro Cell. Dev. Biol. An-im .1997 .3 :3816 吴凤麟.软骨组织工程新进展.J暨南大学学报( 医学版)2004.vol.25 NO.67 PANOSSIAN A . ASHIKCT S . HIRCHHOFF C H . et al .Effects of cell concentration and growth period on a
17、rticular and ear clxmdrocyte transplants for tissue engineeringJPlast Reconstr Surg.2001.108:392 一 4028 王旭，吴军，王甲汉，等.复合皮搜盖烧伤创面的实验研究.第三军医大学学报，1996;18;191 一 194.9 周宏扔 谭谦 皮肤组织工程学研究进展.J中华烧伤杂志 2001,Vol.17,No.110 陈兵,张柏根.血管组织工程研究进展和方向中华外科杂志 2004 , Vol . 42 ,No. 511 Bader A , Steinhoff G, Strobl K, et al . Engineering of human vascular aortic tissue based on a xenogeneic starter matrix. Transplantation ,2000 , 70 : 7214.
