1、课题1 微生物的实验室培养,一、基础知识,（一）培养基,1、概念,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,2、培养基的类型和用途,（1）按物理性质划分：,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,注：（固体、半固体培养基需添加凝固剂，如琼脂；两者的差别是添加量的多、少；液体培养基不加凝固剂。）,（用于工业生产）,（微生物保存、分离、鉴定、活菌计数）,（观察微生物的运动、分类、鉴定）,液体培养基与固体培养基,（2）按化学成分划分：,合成培养基,培养基成分明确（用化学成分已知的化合物配制）,（微生物的分类、鉴定）,天然培养基,含化学成分不明的天然物质,（工业生产）,（3）按
2、用途划分：,选择培养基,加入某化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要微生物的生长。,（作用：分离微生物、进行选择培养，进行选择培养可以增加所需目的菌的浓度。）,青霉素,基因工程，对导入重组质粒的大肠杆菌的筛选,不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物,加入青霉素的培养基:分离到酵母菌、霉菌等真菌,加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌,不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌,鉴别培养基,根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。,伊红美蓝,A,A,B,B,C,C,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上菌落呈现黑色,注：病毒专性活细胞寄生，目
3、前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增值。常用于培养动物病毒的是活鸡胚。,3、培养基的成分,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。,（1）碳源,为微生物提供所需碳元素的营养物质，需要量最大。,概念：,来源：,无机碳源：CO2、NaHCO3等,有机碳源：糖类（常用的碳源尤其是葡萄糖） 、脂肪酸、花生粉饼、石油等,作用：,构成细胞的物质和一些代谢产物；,有些是异养微生物的能源；,思考：大肠杆菌，硝化细菌，蓝藻，乳酸菌分别选用哪种碳源？,糖类，二氧化碳，二氧化碳，糖类,（2）氮源,概念：,为微生物提供所需氮元素的营养物质。,来源：,无机氮源：N2、NH3 、 NH4+、N
4、O3-等。,有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等,作用：,主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物。,注：“含C、N”的有机物常是异养微生物的氮源，也是碳源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是单一方面的作用。,思考：培养根瘤菌、大肠杆菌、硝化细菌时分别需要哪一类氮源？,N2，铵盐或硝酸盐，NH3,（3）水,（4）无机盐,（5）培养基内所需的其他条件,概念：,微生物生长不可缺少的微量有机物。,注：并不是所有微生物都需要添加特殊营养物质，有些需要添加，原因是它们自身缺乏合成这些物质的酶或合成能力有限。如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素。,来源：,维生素、氨基酸、碱基等。,作用：,酶、核
5、酸的组成成分。,、特殊营养物质（生长因子）,、pH值,如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性。,、氧气的含量,如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件。,4、培养基的配制原则,（1）目的要明确（根据微生物的种类、培养目的）,（2）营养协调 （注意营养物质的浓度和比例）,（3）pH适宜,例1：为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制的培养基的配方如下表：,(1)该培养基所含的碳源有_ _，其功能是_。 (2)该培养基所含的氮源是_，其功能是_。 (3)该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是_。 (4)该细菌在同化作用上的代谢类型是_。 (5)该培养基可用来鉴别哪种细菌( )A霉菌
6、B大肠杆菌 C酵母菌 D乳酸菌,乳糖、蔗糖、蛋白胨,构成微生物的细胞物质和一些代谢产物,蛋白胨,合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物,水、无机盐,异养型,C,（二）无菌技术,1、概念,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,获得纯净培养物的关键（目的）:防止外来杂菌的入侵。,2、无菌技术包括的四个方面（措施）,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；,（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；,（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；,（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,3、消毒与灭菌,（1）消毒,概念：,使用较为温和的物理或
7、化学方法仅杀死物体表面或内部一 部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。,在生物体的一定部位产生一种特殊的生殖细胞叫孢子。孢子的特点是能直接长成新个体。,常用方法:,a、煮沸消毒法,100煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。,b、巴氏消毒法,70-75下煮30min或 80下煮15min，对一些不耐高温的液体，如牛奶的消毒。,c、化学药剂消毒,酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭双手、 氯气消毒水源等。,d、紫外线消毒,对接种室、接种箱或超净工作台首先喷
8、洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒。只适用于表面灭菌和空气灭菌。,（2）灭菌,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。,常用方法:,a、灼烧灭菌,用于金属用具（接种环、接种针）、接种过程中试管口和瓶口的灭菌；,b、干热灭菌,160170 ，12h。能耐高温的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金属用具的灭菌 ，所用设备是干热灭菌箱 ；,c、高压蒸汽灭菌,121，100kPa，15-30分钟。用于培养基、无菌水等的灭菌 ，所用设备是高压蒸汽灭菌锅。,二、实验操作(以培养大肠杆菌为例),（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基,1、计算,2、称量,注意：牛肉膏比
9、较黏稠，天平称量时，放等大的称量纸，防止牛肉膏粘在托盘上；牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，称取时动作迅速，称后要及时盖上瓶盖。,3、溶化,牛肉膏和称量纸+水,取出称量纸,加热,加蛋白胨和氯化钠,搅拌,加琼脂（不断搅拌，防止糊底而导致烧杯破裂）,补加蒸馏水至100ml,思考,溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?,可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中,减少误差。,加琼脂的目的是什么?,作为凝固剂,4、灭菌,培养基：高压蒸汽灭菌,培养皿：干热灭菌,思考,在灭菌前, 用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是什么？,灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞； 取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染
10、的作用。,培养皿能否用高压蒸汽灭菌？,不能,因为培养皿要保持干燥,应该用干热灭菌。,在培养微生物时，由于不同微生物适应的PH不同，因此在熔化后必须条件PH，那么是先调PH还是先灭菌?,先调PH，后灭菌。,5、倒平板,用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。,灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,思考,培养基灭菌后要冷却到50时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,又可以避免培养基中的水分过快地挥发。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最
11、好不要用这个平板培养微生物。,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,（二）纯化大肠杆菌,1、纯化培养技术：,自然环境中，微生物混在一起生长，要想纯培养，首先要将单个细胞与其他细胞分离开，进而培养成可见的群体（即菌落）。,2、细菌的菌落,定义：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。,特征：,大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,功能：,菌种鉴定的重要依据。,形态各异的菌落,3、常用接种方法,平板划线法,稀释涂布平板法,（主要用于纯化培养）
12、,（主要用于分离菌种并计数）,(1)平板划线法：,通过接种环在固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可分离到由一个细胞繁殖而来的菌落。,接种环,平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作结束后灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境及感染操作者。,思考,第一步灼烧：消灭接种环上的微生物避免污染培养物；,每次划线前灼烧：为了杀死上一次划线结束后，接种环残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数
13、的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,(2)稀释涂布平板法：,将菌液进行一系列的梯度稀释后，分别涂布到固体培养基表面。稀释度足够高时，能培养出单个菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,涂布器,系列稀释操作,涂布平板操作,对涂布器进行灼烧灭菌
14、； 吸管头不要接触任何物体； 在火焰周围迅速操作。,接种过程中如何进行无菌操作？,思考,将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养1224h后进行观察并记录结果。,未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,三、结果分析与评价,1、未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？,2、在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？,培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长
15、、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,3、培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？,4、如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。,将菌种接种到试管的固体斜面培养基，放入4冰箱中保存。以后每36个月，要将菌种转移到新的培养基。,四、课题延伸,1、菌种的临时保存：,2菌种的长期保存：,3ml甘油瓶中装入1ml甘油后灭菌，再加入1ml菌液，混匀后放入-20冷冻箱保存。,例2：高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是
16、（ ） A将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中 B将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上C将转基因植物叶片接种到无菌培养基上 D将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上,C,例3：下列有关细菌培养的叙述，正确的是（ ） A在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌 B在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长 C向液体培养基中通人氧气能促进破伤风杆菌的生长 D在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动,D,例4：某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。 (1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了_和_。
17、除此之外，培养基还必须含有的基本成分是_和_。 (2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_。 (3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于_中培养，培养的温度设定在37。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_作为对照进行实验。,氮源,碳源,无机盐,水,高压蒸汽灭菌,恒温培养箱,无菌水,(4)培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_。 (5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_细菌，这种培养基被称为_。,多,高,盐(或NaCl),选择性培养基,例5：氯苯化合
18、物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(如图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如下表。,(1)配制号固体培养基时，除添加号液体培养基成分外，还应添加1%的_。 (2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是_。,琼脂,先调pH、后灭菌,(3)从用途上来说，号培养基和号培养基分别属于_培养基和_培养基。在号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是_。,通用,选择,硝酸铵,(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为_。 (5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知，SP1菌在_ _培养条件下最早停止生长，其原因是_。,芽孢,20mg/L氯苯,碳源最早耗尽,
