1、酵母细胞的固定化,课题3,如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混中产物中，可能影响产品质量。,课题背景,于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。,酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定？自20世纪70年代，在
2、固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用。,通过课题背景分析，你有何体会？,酶：,固定化酶：,固定化细胞：,思考:,优点：,实际问题：,设想：,催化效率高，低耗能，低污染,对强酸、强碱、高温等环境条件敏感，易失活；,反应后酶混在产物中，如不去除，会影响产品的品质.,将酶固定在不溶于水的载体上.,溶液中的酶很难收回，不能被再次利用，提高了生产成本；,酶既能与反应物接触，又容易与反应物分离，同时，还可以反复利用.,优点：,实际问题：,一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中
3、，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能完成的.,酶是细胞合成的，能否将合成酶的细胞直接.固定？,成本低，操作更容易.,设想：,优点：,阅读P49-50，并思考： 1、解决酶应用中存在问题的方法是什么？ 2、这种方法的优点是什么？ 3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？ 4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？ 5、了解高果糖浆生产过程。,一、固定化酶的应用实例,基础知识,固定化酶技术。即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。,（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离； （2）固定在载体上的酶可以被反复利用。,1、解决酶应用中存在问题的方法是什么？,2、
4、这种方法的优点是什么？,3、什么是高果糖浆？使用它有何好处？,一、固定化酶的应用实例,高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。,4、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？,生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶； 其作用是将葡萄糖转化为果糖； 这种酶稳定性好，可持续发挥作用。,5、了解高果糖浆生产过程。,注意反应柱的各部分名称。 高果糖浆的生产过程你能说出反应柱的优点吗？,反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。,思考：在生产实际中使用固定化酶技术有什么不足?有什么解决办法?,
5、一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。,不足：,解决办法：,可采用固定化细胞技术。,1、什么是固定化酶或细胞技术？,阅读P50内容，思考以下问题：,二、固定化细胞技术,2、细胞（或酶）固定化的常用方法有哪些？,3、酶和细胞固定方法的选择及原因？,4、固定化细胞常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？,二、固定化细胞技术,1、什么是固定化酶或细胞技术？,2、细胞（或酶）固定化的常用方法有哪些？,利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。,包埋法,将酶（或细胞）包埋在细微网格里,化学结合法,将酶（或细胞）相互连接起来,吸附法,
6、将酶（或细胞）吸附在载体表面,3、酶和细胞固定方法的选择及原因？,酶适合采用化学结合和物理吸附法固定,细胞适合采用包埋法固定,（1）方法,（2）原因,细胞体积大，酶分子很小,体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋的材料中漏出,4、固定化细胞常用的不溶于水的多孔性载体有哪些？,明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等,1从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？,固定化细胞技术,固定化细胞固定的是一系列酶,固定化细胞技术,固定化酶技术,2固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？,3如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反
7、应，应该选择哪种方法？,4如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？,思考,（大分子物质不能进入细胞）,（一）制备固定化酵母细胞,阅读P5051思考下列问题：,（1）制备过程包括哪几个步骤？ （2）你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？ （3）各步骤应当分别注意什么问题？,实验操作,1、酵母细胞的活化,思考：关于酵母菌你有哪些知识？,（一）制备固定化酵母细胞,什么是活化？其本质是什么？ 活化的方法是什么？具体操作过程？ 操作过程中应注意什么？,1、酵母细胞的活化,（一）制备固定化酵母细胞,本质：,方法：,活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。,加快新陈代谢。,加入适量的水。,操作
8、过程：,注意事项：,取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。,（1）所用容器要大一些； （2）要保证酵母菌的活性； （3）物种要单一； （4）注意水的用量。,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液,称取无水 CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果。,操作过程：,注意事项：,3、配制海藻酸钠溶液,称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中。加人10mL蒸馏水，用酒精灯加热，边加热
9、边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。,加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。,操作过程：,注意事项：,包埋酶或细胞,防止焦糊,配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？,在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？,思考,加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。 如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。,特别提醒,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，
10、再转移至注射器中。,操作过程：,注意事项：,溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌。,搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。,4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合,5、固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。,操作过程：,可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照。,海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右。,注意事项：,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。 检验凝胶珠的质量是否合格，
11、可以使用下列方法： 一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,特别提醒,（二）用固定化酵母细胞发酵,操作过程：,注意事项：,1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用 蒸馏水冲洗2-3次。 2、将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25下发酵24h。,控制好发酵温度，一般是室温25。,发酵时间一般时间稍长一些，效果明显。,可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果。,结果分析与评价,如果制作的
12、凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少。,（一）观察凝胶珠的颜色和形状,如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？,如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。,当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？为什么？,利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。,（二）观察发酵的葡萄糖溶液,1.,1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是 A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础 B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础 C 酶固定化技术与细胞固定化技术是
13、同时发展起来的 D 固定化细胞技术先于酶固定化技术,练习巩固,2、固定化酶技术常采用 A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法 C 活化法 D 微囊化法 3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进其溶解，采用的最好加热方法是 A 快速加热 B 持续高温加热 C 小火间断加热 D 灼烧加热,4、酵母菌的活化是指 A 让酵母细胞恢复运动状态 B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠 C 让酵母细胞内酶活性加倍 D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态,5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是 A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产 B 成本更高、操作更难、不能连续性生产 C
14、 成本更低、操作更容易、能连续性生产 D 成本更低、操作更难、能连续性生产,6、下列说法不正确的是 A、葡萄糖与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成的是果糖 B、从固定化酶反应柱下端流出的是果糖 C、高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病 D、酶溶解于葡萄糖溶液，可以从糖浆中回收,7、研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸三酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可以用来降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的 A、温度 B、PH C、水分 D、营养,8、目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自 A、化学合成 B、动物体内
15、C、植物体内 D、微生物体内,9.使用固定化细胞的优点是 A.能催化大分子物质的水解 B.可催化一系列化学反应 C.与反应物易接近 D.有利于酶在细胞外发挥作用,10.酶的固定方法不包括 A. 将酶吸附在固体表面上 B将酶相互连接起来 C将酶包埋在细微网格里 D将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶,11、如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制 A直接使用酶 B使用化学方法结合的酶 C使用固定化细胞 D使用物理吸附法固定的酶,12、下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是 A酶分子很小，易采用包埋法 B酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶 C细胞个大，难被吸附或结合 D细胞易采用包埋法固定,13. 关于固定化酶的叙述不正确的是 A既能与反应物接触，又能与反应 物分离 B固定在载体上的酶可被反复利用 C可催化一系列反应 D酶的活性和稳定性受到限制,14、固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是 A避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程 B固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用 C促化反应结束后，能被吸收和重复利用 D细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用,15、如果反应物是大分子物质，一般不采用固定化细胞技术，主要原因是 A大分子物质运输过程中耗能多 B大分子物质难以自由通过细胞膜 C大分子物质反应物装到一个反应柱内，可再次利用 以上说法都正确,
