1、This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。标 准 文 件Standard document文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00页 码Page 1 / 9状 态Status正式Formal高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC 备 份 号Control No.起 草 人Written by
2、起草日期Written date 年 月 日审 核 人Reviewed by审核日期Reviewed date 年 月 日颁发部门Issued department质量管理部Quality department批 准 人Approved by批准日期Approved date 年 月 日生效日期Effective date 年 月 日分发部门 Distributed department：质量负责人 质量管理部 QA QC1、目的 Objective：建立高效液相色谱仪内部校验规程，确保校验工作规范、顺利进行。2、范围 Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/
3、二极管阵列检测器）的校验。3、职责 Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。3.2 QC：负责制定本规程，并对本规程的实施负责。3.3 QA：负责监督和检查本规程的实施。4、定义 Definition：无。5、程序 Procedures：5.1 依据国家计量校验规程 JJG 705-2002 液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。5.2 备件及材料5.2.1 水：HPLC 级水。5.2.2 化学试剂：乙腈（ HPLC） 、丙酮（分析纯） 。5.2.3 咖啡因标准品。5.2.4 咖啡因标样。0.005 mg/ml, 0
4、.010 mg/ml, 0.025 mg/ml,0.050 mg/ml,0.125 mg/ml 和 0.250 mg/ml 咖啡因水溶液。5.2.5 色谱柱： 4.6mm250mm，C18 ，5m。5.2.6 容量瓶： 10ml。文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 2 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is f
5、orbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。5.2.7 玻璃注射器。5.2.8 限流阻尼管。5.2.9 分析天平。5.2.10 秒表。5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1 泵性能的测试表 1校 验 项 目 指 标流量设定值(ml/min) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5流量设定值误差，|S S | 5% 2% 2% 2% 2%流量稳定性误差，S R 3% 2% 2% 2% 2%5.3.2 柱温箱温度稳定性测试*表 2校 验 项 目 指 标温度设定值 () 20 25 30 35 40温度设定值误差 |T|2控温稳定性误差 TC
6、 1备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。5.3.3 检测器性能测试表 3校 验 项 目 指 标基线噪声： 510 -4AU基线漂移： 510 -3AU/h波长准确度： |2nm0.999线性测试： 相关系数 R响应因子 f 的 RSD 5.0%文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 3 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pha
7、rm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。5.3.4 进样器性能测试表 4校 验 项 目 指 标定性重复性(Rt)RSD 定性 1.0%进样器精密度测试：定量重复性(峰面积) RSD 定量 2.0%0.999自动进样器线性测试*： 相关系数 R响应因子 f 的 RSD 5.0%5.3.5 梯度组成的测试 *表 5校 验 项 目 指 标梯度准确度 |TSH-MSH|2%梯度准确度的精密度 0.5%注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目
8、。5.4 校验方法5.4.1 校验通则5.4.1.1 HPLC 的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。5.4.1.2 政府部门每一年对 HPLC 进行校验，每六个月内部对 HPLC 进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。5.4.1.3 校验时，同时检查、确认仪器的安装，使用环境符合要求，仪器处于正常的状态下，并检查、确认仪器的接线牢固，接地良好。5.4.1.4 不同配置的仪器，须按照规定的校验项目及指标进行内部校验，以保证该仪器的所有使用功能均进行了校验。5.4.2 泵
9、性能的测试 SS 和 SR 的测定5.4.2.1 测试条件： 流动相：水；色谱柱：限流阻尼管。5.4.2.2 测试：文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 4 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。分别设定流速为 0.5ml/m
10、in， 1.0ml/min，1.5ml/min，2.0ml/min，2.5ml/min 等值进行校验，这些流速覆盖了实验室使用的流速范围。待流速稳定后，在流动相流出口处用容量瓶准确地收集流动相 10.0ml，同时用秒表计时，各测量 3 次，按公式(1) 、(2)计算SS 和 SR，并以下表所列内容记录测试数据和结果。表 6 泵性能的测试泵流量设定值： 流动相体积： 次数项目1 2 3收集时间 t(秒)流量实测值 Fm(ml/min)泵流量设定值误差 SS泵流量稳定性误差 SR5.4.3 柱温箱温度稳定性测试T 和 Tc 的校验5.4.3.1 测试将测温仪之热电偶固定在柱温箱中央，关好柱箱门。以
11、限流阻尼管替代色谱柱，分别设定柱温箱温度为 20 ，25 ，30，35，40等值进行校验，这些温度覆盖了实验室使用的柱温范围。待测温仪指示温度稳定后，记录温度显示值，每隔 5 分钟测一次，每个温控点测定 1 小时，求出平均值，并以下表所列内容记录测试数据和结果。设定值与平均值之差为设定值误差T，13 次测量值中最大值与最小值之差为控温稳定性误差Tc。表 7 柱温箱温度稳定性测试温度设定值： 次数项目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 平均值温度实测值设定值误差T稳定性误差 Tc5.4.4 检测器性能测试5.4.4.1 基线漂移和基线噪声的测试5.4.4.1.1 测试条
12、件 文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 5 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。检测波长：254nm；流动相：水；流速：1.0ml/min；色谱柱：4.6mm 250mm，C18，5 m。5.4.4.1.2 测试按不同的仪
13、器配置，设定检测器的灵敏度为较灵敏值。待系统平衡后，调整基线在图谱的中部位置，记录基线 30 分钟。以图谱显示的刻度值或灵敏度与积分仪的匹配关系，计算基线噪声和漂移值。基线噪声为峰峰噪声，选择最大的噪声作为基线噪声。计算方法：基线噪声图谱单位距离对应的吸光度 AU噪声峰峰间的垂直距离。漂移值为 30 分钟内噪声的最高值和最低值之间垂直距离 L 对应的吸光度 AU。计算方法：漂移值图谱单位距离对应的吸光度 AUL/0.5h。5.4.4.2 波长准确度的测试5.4.4.2.1 DAD/PDA 的测试取咖啡因标样 2)进样，记录色谱图和 200nm400nm 范围内的紫外吸收图谱，其205nm 处的
14、最大吸收处波长与 205nm 比较，其 273nm 处的最大吸收处波长与 273nm比较，最小吸收处的波长与 245nm 比较，三波长处的差值 | 均应2nm 。5.4.4.2.2 UV 检测器的测试a.具备紫外图谱扫描功能的检测器：以水流过流通池时作一空白扫描，然后，以手动方式将咖啡因标样 2)注入流通池，扫描 200nm300nm 范围内的紫外吸收图谱。记录咖啡因最大吸收和最小吸收处的波长，其 205nm 处的最大吸收波长与 205nm 比较，其273nm 处的最大吸收波长与 273nm 比较， 最小吸收波长与 245nm 比较，三波长处的差值| |均应2nm。b.不具备紫外图谱扫描功能的
15、检测器：以水注入流通池调零，然后，将咖啡因标样 2)注入流通池，通过设定不同波长，记录 205nm、245nm、273nm 三个波长上下各 5 个nm 范围内的吸收度 A 或流通池参比能量 R 与样品能量 S 的比值，205nm、273nm 波长处各取该波长范围内最大的吸收值或比值对应的波长为测定波长；245nm 波长处取该波长范围内最小的吸收值或比值对应的波长为测定波长。测定波长分别与对应的波长205nm、245nm、273nm 比较，三波长处的差值|均应2nm。5.4.4.2.3 线性测试文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibra
16、tion SOP for HPLC页 码Page 6 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。a测试条件流速：1.5ml/min； 流动相：水- 乙腈=85 ：15； 检测波长：273nm ；色谱柱：4.6mm 250mm，C18，5 m。b测试待系统平衡后， 分别取咖啡因标样 1)、2)、3)、4) 、5)、6)，手动进样器依仪器配置之定
17、量环的体积进样，记录色谱图。以标样浓度 Ci 为横坐标，以咖啡因峰面积 Ai 为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数 R。对各标样浓度的响应因子 fi 进行数理统计，按公式（3）计算其 RSD。其中 fi =Ci/Ai。5.4.5 进样器性能测试5.4.5.1 定性、定量重复性的测试a.测试条件流速：1.5ml/min；流动相：水-乙腈=85：15；检测波长：273nm；色谱柱：4.6mm 250mm，C18，5 m。b.测试取咖啡因标样 5)（浓度为 0.125mg/ml） ，自动进样器以 5l，10 l，20l 的体积各连续进样 6 次；手动进样器依仪器配置之定量环的体积连续进样 6
18、次，记录色谱图，以咖啡因峰的保留时间和峰面积，按公式(3)计算相对标准偏差 RSD，并以下表所列内容记录测试数据和结果。表 8 定性、定量重复性的测试进样体积 次数 n 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD保留时间(min)峰面积5.4.5.2 线性测试a测试条件流速：1.5ml/min； 流动相：水-乙腈=85：15； 文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 7 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pha
19、rm. Co., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。检测波长：273nm；色谱柱：4.6mm 250mm，C18，5 m。b测试取咖啡因标样 3)（浓度为 0.025mg/ml） ，分别以 5l，10 l，15l ，20l ，25l的体积进样，记录色谱图。以进样体积 V i 为横坐标，以咖啡因峰面积 Ai 为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数 R。对各进样体积对应的响应因子 fi 进行数理统计，按公式（3）计算其 RSD。其中 fi =Vi/Ai。 5.4.6
20、梯度组成测试5.4.6.1 测试条件流速： 2.0ml/min；流动相 1：水；流动相 2： 0.5% 丙酮的水溶液；检测波长：265nm；色谱柱：限流阻尼管。5.4.6.2 测试以限流阻尼管替代色谱柱，以流动相 1 平衡系统，通道 A、B 匹配（或通道 C、D 匹配） ，按下表之梯度程序，平行测试 3 次，记录色谱图。将色谱图按 0%到 100%B（或D）重新标定刻度，以测定每个梯级的理论高度（ TSH）与实测高度（MSH ） ，见图1“梯度组成准确度示意图” ，其差值（TSH-MSH）即为准确度，以%B（或 D）单位表示。取 3 次测定中 50.0%B、6.0%B 和 5.0%B（或 D）
21、等值的准确度进行数理统计，计算其准确度的精密度 SD。表 9 梯度测试程序表时间(分) %通道 A(或 C)：流动相 1 %通道 B (或 D) ：流动相 21.00 100 0.01.01 0.0 1006.00 0.0 1006.01 10.0 90.09.00 10.0 90.09.01 11.0 89.0文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 8 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co
22、., Ltd. Any unauthorized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。12.00 11.0 89.012.01 49.0 51.016.00 49.0 51.016.01 50.0 50.019.00 50.0 50.019.01 94.0 6.023.00 94.0 6.023.01 95.0 5.026.00 95.0 5.026.01 100.0 0.0图 1 梯度组成准确度示意图5.5 计算公式SS=(Fm-Fs)/Fs100% (1)SR=(Fmax-Fmin)/ F100% (2)其中
23、：Fm=10.0 60/t 为流量实测值(ml/min) t ：收集流动相的时间(秒)Fs ，Fmax，Fmin，F ：分别为同一组测量中流量设定值、流量最大值、最小值、平均值(ml/min)RSD= 100% (3)2()1xinSD= (4)2()1xin5.6 结果及结论文件编号Document No. SOP-LOP-790-8/00高效液相色谱仪校验规程Calibration SOP for HPLC页 码Page 9 / 9This Document can only be used in JingDeZhen FuXiang Pharm. Co., Ltd. Any unauth
24、orized use and copy is forbidden. 仅限景德镇市富祥药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用或拷贝。每台 HPLC 校验完毕，由 QC 主管对校验记录和结果进行复核，无误后，依据该HPLC 的配置，发出校验报告，并交领导审核。6、参考资料 References：无。7、相关文件和记录 Documents and Records：无。8、变更 / 修订记录 Changes / revision records：文件编号Document No.生效日期Effective date变更/修订的原因、依据及详细变更内容Cause of changes/revisions, basis and detailed change contentsSOP-LOP-790-8/00 2012.02.07 新订文件(以下为空白 ) (The following is blank)
