1、实验六 等电聚焦 （Isoelectrofocusing, IEF）,实 验 内 容,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 两性电解质和pH梯度的形成 pH梯度的测定 样品等电点的计算,制胶（1小时） 聚焦（4小时） pH梯度的测定（第二天） 样品等电点的计算（课后完成）,等电聚焦（isoelectric focusing），缩写为IEF或EF，也称等电分离、等电点划分，等电点分析、聚焦电泳等，是单相电泳中具有最高分辨率的技术。 IEF可以用来鉴定和测定蛋白质等电点，分离具有不同等电点的复合蛋白质,实 验 原 理,蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）蛋白质在不同的pH环境中带不
2、同数量的正电荷或负电荷，蛋白质的净电荷为零的pH值即为pI。 电场中，蛋白质在大于pI的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于pI的pH环境中以阳离子形式向负极移动 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，在其中加入两性电解质载体(carrier ampholines)，在电场作用下，两性电解质载体可以形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。如果在其中加入蛋白质，在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 按等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集的行为即是聚焦。聚焦部位的蛋白质净电荷为零，聚焦部位的pH即为该蛋白质的等电点,两性电解质,两性电解质：由多
3、种氨基与羧基比例不同的脂肪族多氨基多羧酸同系物和异构物混合构成。当电场中通直流电时，它们依各自氨基与羧基比例的不同而按其等电点的次序排列，从而在两极间形成一个稳定的由阳极到阴极逐渐增加pH的平滑梯度。商品名为Ampholine。理想载体两性电解质的条件： 1、分子量小，可通过透析或分子筛法除去。 2、可溶性好。 3、缓冲能力强。 4、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。 5、紫外吸收低，不发荧光。 6、化学性能稳定。,pH梯度的形成,正负极间引入两性电解质（即在灌制聚丙烯酰胺凝胶的时候将两性电解质加到未聚合的凝胶中）； 在正极端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢
4、氧化钠、氨水等。 电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。 电泳开始后，混合物中pI最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。 由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。 pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2pI1，因此定位于第一种两性电解质之后。 以此类推，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，
5、由低到高的线性pH梯度。,分辨率很高，可把pI相差0. 01的蛋白质分开样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用电泳结束后，可直接测定蛋白质pI分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。,IEF的优点：,IEF的缺点：,电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时部分蛋白质溶解度差，易发生沉淀。可通过在样品中多加些两性电解质加以克服；许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决,实 验 步 骤,制胶 每组（两人）两支0.5cm10cm的玻管，用parafilm膜封住一端管口，未封口朝上垂直将玻管立于制胶管架上
6、，加入40蔗糖23滴，然后加按照下表配制的凝胶液约2ml于玻管中，直至离玻管顶端 1cm处为止，上面再以23滴蒸馏水封胶，37C凝胶0.5-1h,30% Acr/Bis 1.5 ml Ampholine（pH3.5-10） 0.3 ml H2O 3.735 ml 2mg/ml BSA （待测蛋白） 0.4 ml6 ml 10%APS 0.06 ml TEMED 0. 005 ml,6ml/2人 可以做3管！,2. 聚焦电泳 1）用滤纸吸去凝胶管顶端的水，剥去管底parafilm，使蔗糖液流出，并用少量蒸馏水洗涤。 2）将凝胶管塞入圆盘电泳装置的孔中，空孔用无孔胶塞封住。 3）下槽倒入20g/L
7、 NaOH溶液，用针管吸取少量NaOH溶液加入凝胶管的底部，以排出其中的气泡。将固定好凝胶管的上槽装在下槽上。检测下槽中的NaOH是否没过凝底部。 4）在上槽加入适量5%磷酸溶液，检查是否漏液；如不漏液，继续加入磷酸溶液，液面需没过胶面。用针管吸取少量磷酸溶液加入凝胶管的上部，排除凝胶管上部的气泡。 5）上槽接正极，下槽接负极，恒压160V开始泳动，直至电流为零，约4hr。 6）聚焦结束后取出凝胶管，先用蒸馏水将两端电泳液充分洗去，再用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。标明胶条正负端
8、，并编号。,3.胶条处理每组两个胶条，均测量长度并记录（胶条1为L1，胶条2为L2），随后分别进行如下处理： 1）胶条1：目的是判定聚焦后蛋白带的相对位置！ 放入培养皿中，加入12%三氯乙酸溶液固定，直至白色蛋白条带出现；凝胶条置于玻璃板上，量出蛋白带中心距正极端的距离（L）和凝胶条的长度（L1 ）。计算出未固定时蛋白带距离正极的长度L。假设固定后蛋白带的相对位置不变！L=LL1/L1 2）胶条2：目的是做pH梯度曲线！平放在玻璃板上，从凝胶的正极端开始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已编号并装有1 ml蒸馏水的试管中，浸泡过夜。次日上午用pH试纸测量溶液的pH值，记录。,4. 做pH梯度曲
9、线并计算蛋白质等电点1）以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度曲线。2）计算出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度，直接从pH梯度曲线上求出该蛋白质等电点。假设在不同凝胶条中，蛋白聚焦之后的相对位置是固定的！,思 考,等电聚焦结合SDS-PAGE电泳可以用来做什么？,解 疑,1、在电压达到预定值后，电流为什么会降低？ 答： 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。2、为什么在两个电极丝附近有气泡产生？ 答：等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。,双向电泳,
