1、1土壤生态学曹志平 胡菊编2007 年 10 月 24 日资源环境学院生态系2实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量-1实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定-4实验三、土壤螨类的分离-6实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳3实验一、培养计数法测定土壤原生动物数量目前国际上通常采用的有直接计数法和间接计数法两种。直接计数法（direct counting method） ，顾名思义，就是对土壤中的原生动物不进行培养，而是取一定量的新鲜土壤，加一定量的水或土壤浸出液，摇匀后即进行镜检，得到土壤原生动物丰度（单位重量土壤中的原生动物个数） 。间接记数法主要是培养记数法。鉴于土壤这一特定环境
2、，土壤原生动物种类都能形成胞囊，以渡过土壤干旱环境。风干后土壤原生动物形成的胞囊，用培养的方法诱导脱开胞囊，以推知其种类和数量分布。在培养过程中一切器皿、培养基均经高压灭菌，接种时也应避免尘埃落入，以确保培养不受污染。本实验主要采用 Singh（1995）和Stout（1962）的 “3 级 10 倍 ”环式稀释法。仪器、设备和材料烘箱、培养箱、灭菌锅、培养箱、镊子、玻璃环、三角瓶、烧杯等。方法与步骤 1 土样采集土壤原生动物很难直接从土壤、水体中采集，要通过室内培养。土壤原生动物在土壤环境干旱时，都能形成胞囊，以等待土壤水分来临后再脱胞囊而活动。所以土壤原生动物的采集，实际上是采集土壤样品，
3、带回实验室进行培养而取得标本。由于原生动物在土壤中的分布是不均匀的，因此在一个采样区内，需采集 10 个采样点。用圆形采样器取土样，把土样放入铝盒带回室内。在培养之前，需测定土样含水量。2 稀释土样2 克风干土样（如有条件，也可以直接用湿土）加 18 毫升无菌水，充分振荡，可用超声波仪粉碎土壤，使之与水充分混合，这时的稀释度为 10；然后用定量吸管吸取 2 毫升102 的土壤悬浮液，加入 18 毫升无菌水，充分摇匀，此时稀释度为 103。依此法逐级稀释，即可得到 103、10 4、10 5、10 6的稀释液。根据原生动物的丰富度选择土壤的稀释度，但每一定量土样均要选择连续的 3 个稀释度， ，
4、即“3 级 10 倍”之意（图 1） 。3 培养基制备0.5 克氯化钠加 1.2 克琼脂加 98 毫升蒸馏水（如用量较多，可按此比例增加） ，搅拌后在高压灭菌锅中加热灭菌，然后趁热到入培养皿，在凝固之前插入 5 个内径为 1.8 厘米、高为 0.6 厘米的玻璃环。每个土样需 6 个培养皿 30 个玻璃环。4 接种、培养和镜检取其中的连续 3 级悬浮液，摇匀后每级稀释液各取 1ml 接种于各自的玻璃杯内，即1、2 号培养皿的 10 个玻璃杯内各滴入 1ml 第一级稀释液，同样 3、4 号和 5、6 号培养皿的 10 个玻璃杯内分别滴入第二级和第三级稀释液（第一、二、三级稀释液的稀释度是多少，则取
5、决于研究的土壤中原生动物数目的多寡，如采用 104-106 稀释度系列，则第一级稀释液为 104，第二级为 105，第三级为 106） ，置于光照培养箱 25以下培养(图 1)。分别在第4、7、11 天时在低倍镜下观察每个环中有无原生动物，按肉足虫、鞭毛虫、纤毛虫分别记录。低倍镜下可分清此三大类，但无法鉴定种类。可在实验结束时，再吸出在高倍镜或油镜下鉴定种类。4图 1 土壤原生动物定量培养法的稀释和接种示意图5 结果统计根据未出现环数，查 Stout“3 级 10 倍稀释法” （表 1）原生动物密度换算表得知每克土壤中的原生动物数量，即密度。例如，已知鞭毛虫在 30 个环中有 5 环中未出现，
6、则查表得 =69.5，若稀释度为 104-106，则鞭毛虫的密度为 695000 个/克土壤。肉足虫和纤毛虫的密度也同此法求得，三大类密度之和即为总的原生动物密度。这是根据微生物数量统计法的原理从没有原生动物和土壤稀释度求出最或然数（MPN） ，以此推断每克风干土壤中原生动物数量。将表上查得的数量乘以土壤湿度，即为每克湿土中原生动物数量。表 1 “3 级 10 倍”环式稀释法原生动物密度换算表（Stout，1962）土壤中原生动物的个数/g无原生动物的环数10-103 102-104 103-1051 230.3 2303 23030 2303002 160.9 1609 16090 1609
7、003 120.4 1204 12040 1204004 91.6 916 9160 916005 69.5 695 6950 695006 52.0 520 5200 520007 38.7 387 3870 387008 29.2 292 2920 292009 22.7 227 2270 22700510 18.0 180 1800 1800011 14.5 145 1450 1450012 1107 117 1170 1170013 9.42 94 942 942014 7.52 75 752 752015 5.90 59 590 590016 4.56 45 456 456017 3
8、.51 35 351 351018 2.73 27 273 273019 2.16 21 216 216020 1.73 17 173 173021 1.40 14 140 140022 1.14 11 114 114023 0.92 9 92 92024 0.74 7 74 74025 0.58 6 58 58026 0.44 4 44 44027 0.31 3 31 31028 0.20 2 20 20029 0.09 1 9 9030 0.00 0 0 06实验二、土壤中线虫的分离方法及杀死固定分离线虫方法多种多样，主要根据分离线虫的种类和数量、寄主植物种类、标本的固有属性、采集时间和所
9、分离线虫的用途而定。本文介绍传统的贝曼漏斗法和经改良后的淘洗过筛离心法。（一） 贝曼漏斗法贝曼漏斗法是 Baermann 于 1917 年提出来。其本原理是：线虫是喜水动物，遇水便会从土壤或植物组织内游出，同时由于地心引力及线虫自身的重量，便会下沉至漏斗的管内集中。这种方法仅限分离活动性的蠕虫型线虫，对死虫、不活动的线虫和虫态（如胞囊线虫和根结线虫的雌虫）则是无效的。仪器、设备和材料贝曼漏斗：试验装置如图 2。常用的是直径为 8-10 厘米的玻璃漏斗，漏斗管连在一段乳胶管，以止水夹（弹簧夹）控制胶管的开闭，漏斗放在或铁架台上或自制的木制漏斗架的圆环内。图 2 贝曼漏斗法（Baermann fu
10、nnel）分离线虫示意图( 刘维志，1995)方法与步骤取土样或含线虫的植物材料（如根系）切成大约 0.5 厘米-1 厘米长的小段，用四层纱布或二层高级卫生纸（棉质）包住土样或根样，轻轻放入盛水的漏斗内，令水漫过、浸透，如水量不足，轻轻加水，防止冲出泥浆，经 48 小时，用空烧杯接在漏斗的胶管内，轻轻松开止水夹，从漏斗流出水，内含大量线虫。关闭胶管，向漏斗轻轻补充清水，可以再次收7集线虫。（二）淘洗过筛离心法淘洗过筛离心法是在几种最基本的分离方法上，为适应大量快速分离线虫的要求而改进的一种方法。其基本原理是根据虫体大小及线虫的密度比水轻或与水的密度接近，线虫在淘洗过程中，可浮在水面或悬浮在水中
11、。在过筛时，依虫体大小可以在不同筛目上收集线虫。过筛时，往往在密筛（如 325 目）上留有很多泥浆。为了进一步把线虫从泥浆中分离出来，可利用比重差异，应用不同浓度的蔗糖溶液或其他制剂（密度比水大） ，结合离心的方法，使收集到的线虫更加纯净。仪器、设备和材料1.仪器、设备40、60、325 目筛子各一，低速离心机，100ml 或大于 100ml 离心管，天平，250ml 烧杯，脸盆，洗瓶，喷头，试管，洗干净的青霉素瓶。2.材料TAF 固定液(三乙醇胺福尔马林固定液 )：吸取 2ml 40%甲醛，7ml 三乙醇胺溶于91ml 蒸馏水。蔗糖溶液：454 克蔗糖溶于 1000ml 水中(密度 1.18
12、g/cm3,浓度为 38.5%)。方法与步骤1 线虫标本的采集。挖取植株根系，去掉 5cm 表土，在根围 5-20cm 深度取带根土样 500cm3 左右，放在大塑料袋中，在小塑料袋中放入标签，注明采集寄主、地点、采集人，将小塑料袋放入大塑料袋中，封口后带回实验室。2 分离过程。淘洗程序：从 40 目、60 目和 325 目筛子上过筛，40 目筛内收集根系（有根结线虫） ，编号后存入塑料袋内，60 目筛内收集胞囊，亦存入塑料袋内，把 325 目筛子里的泥浆（内含线虫）洗入烧杯（150ml 左右） 。离心程序：(1) 将烧杯里的泥浆倒入离心管（250ml） ，称重平衡(2) 将离心管放入离心机中
13、，1000 转/分，离心 4-5 分钟。(3) 倾去上清液，加入蔗糖液（38.5% ） ，称重离心，15 秒钟，1000 转/ 分离心(4) 用烧杯收集上清液，加水稀释，防止蔗糖液渗透压过高虫体破裂。(5) 烧杯中的上清液在 325 目筛子过筛（筛子倾斜） ，将 325 目筛上的线冲洗到烧杯里，再转入试管里将试管垂直放置，过夜（24-48 小时，夏天时间短，春、秋季时间长）饥饿，把上清液用长吸管吸掉，试管底部为线虫。3 杀死.。向试管加入热水到 60，将线虫杀死，15 分钟。4 固定。(1) 将下部虫液用吸管吸入青霉素瓶，加入固定液。(2) 固定一周后，再换洗固定液，永久保存。固定两周后才能进
14、行鉴定。8实验三、土壤螨类的分离仪器、设备和材料1 仪器、设备干漏斗架、40 瓦灯泡若干、塑料瓶、载玻片、盖玻片、解剖镜、挑针、吸管、显微镜。2 试剂霍氏封固剂（Hoyers medium）：配方为阿拉伯树胶 15 克，水合氯醛 100 克，纯甘油10 克，蒸馏水 25 毫升。该封固剂的配制按下列程序进行：先将阿拉伯树胶（粉状或结晶）完全溶解于蒸馏水，然后再加入水合氯醛和甘油，再经过滤去杂。为便于阿拉伯树胶的完全溶解，可稍加大蒸馏水用量，减低了粘度也便于过滤。待滤过后将清夜置如水浴锅上加热以蒸发多加的水分。75%酒精：量取 790ml95%乙醇用蒸馏水稀释 1000ml。方法与步骤1 土壤螨的
15、搜集称量 250300 克土样置干漏斗带铁丝网的盘中，在放置盛有 75%酒精的塑料瓶，注意瓶口于漏斗出口对齐，并注意补充塑料瓶中的酒精溶液防止干涸。这样使用 40 瓦灯泡连续光照 48 小时，盖上塑料瓶既可。2 清洗保存。对体表有粘附物的标本要进行清洗，用细毛笔在 50%酒精中洗涮体表，剔除粘附物，但不要损坏体表结构。以上方法不能去污时，可以将标本放入封固液中，拨动标本，让封固液粘去污物。牢固的粘附物可用超声波震荡仪清洗，根据虫体大小确定清洗时间，防止虫体被震碎。为准确观察虫体结构，应留下一些标本不清洗。3 透明去污后的标本，必须进行透明，最常用的有效方法是用乳酸浸泡。为了缩短透明时间，可放在
16、温箱或灯光下加热，透明时间根据标本大小、温度及乳酸浓度而定。个体越大，温度越低，乳酸浓度越低，透明时间越长。只要标本已透明，就应该将标本取出来放在7075%的酒精中保存。有些甲螨标本，体色极深，可用过氧化氢去色，但不必过份漂白。4 临时玻片与永久玻片的制作临时玻片：用盖玻片封盖凹玻片的半个凹孔加入乳酸，放入标本整形，调整位置，固定，马上可以镜检，完成后放入酒精中保存（图 3） 。永久玻片：将处理好的标本放在载玻片上，沾一小点霍氏封固液于近旁，将标本整肢，象中气门螨类，应尽量使四足伸展，甲螨标本比较圆厚，应固定位置，让封固液稍干后，覆上加有封固液的盖玻片。为了更完整、准确得镜检，还常需解剖标本，
17、解剖需根据标本身体结构，以甲螨为例（图 3） ，可先从后半体背腹沟将后背板剖开，再卸下四足、前背板、口器和基节板、腹板，依次制片。永久玻片干涸后，沿盖玻片四周涂上一圈指甲油，以免受潮滑片。9图 3 螨类标本制片法A.B.临时封片法；C:解剖标本永久制片法实验四、氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(23 mm)，或放在低温下(24)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节
18、到田间持水量的 50%左右，在室温下于密闭装置中预培养 1 周，密闭容器中要放入两个 50mL 的烧杯，分别加入水和稀 NaOH，以保持其湿度和吸收释放的 CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(24)最好不要超过 10d。二、方法氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率
19、 200rev/min)；冰柜；磷酸浴。3、试剂1. 无乙醇氯仿：量取 500 mL 氯仿于 1000 mL 的分液漏斗中，加入 50mL 硫酸溶液10(H2SO4)=5%，充分摇匀，弃除下层硫酸溶液，如此进行 3 次。再加入 50 mL 去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行 5 次。将下层的氯仿转移到蒸馏瓶中，在 62的水浴中蒸馏，馏出液存放在棕色瓶中，并加入约 20g 无水 K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。2. 硫酸钾溶液 c(K2SO4)= 0.5 molL-1: 称取硫酸钾（K 2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至 1L。(可加热溶解)3.重铬酸钾
20、c(1/6K2Cr2O7)=0. 4000 molL-1: 称取经 130 oC 烘干 23h 的重铬酸钾（K 2Cr2O7，分析纯）19.622g，溶于 1000mL 的去离子水中。其他浓度：9.811 g ,4.9055 g,4.邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉指示剂C 12H8N2H2O，分析纯1.49g，溶于含有0.70g FeSO47H2O 的 100mL 去离子水中，密闭保存于棕色瓶中。5.硫酸亚铁溶液 c(FeSO4)=0.0333 molL-1：称取硫酸亚铁(FeSO 47H2O，化学纯)9.26g，溶解于 600800mL 去离子水中，加浓硫酸（化学纯）20mL，搅拌均匀，定容至
21、 1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不稳定，需每天标定其浓度。硫酸亚铁溶液浓度的标定 吸取重铬酸钾标准溶液(试剂 8)5.00mL，放入 100mL 三角瓶中，加水约 20mL,加浓硫酸 5mL 和邻啡罗啉指示剂 2 滴，用 FeSO4溶液滴定，根据 FeSO4溶液的消耗量即可计算 FeSO4溶液的准确浓度。4、操作步骤4.1 薰蒸 称取相当于 20.0g 烘干土重的湿润土壤 3 份，分别放在约 100 mL 的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有 50mL NaOH 溶液和一个装有约 50mL 的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以
22、增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为 0.5mm 的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少 2 min。关闭干燥器的阀门，在 25oC 的黑暗条件下放置 24h。打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒回瓶中可重复使用。擦尽干燥器底部，用真空泵反复抽气，每一次都要打开干燥器，以加快除去氯仿的速度，直到土壤闻不到氯仿气味为止。5.2 浸提 薰蒸结束后，将土壤全部转移到 250 mL 的三角瓶中，加入 40 mL 0.5mol/LK2SO4溶液，在振荡机上振荡浸提 30min（25
23、，185rev/min） （转速根据仪器进行调整，必须使得土壤完全振荡开）,过滤。薰蒸开始的同时，称取等量土壤 3 份，同上用 K2SO4溶液(试剂 2)浸提，同时做不加土壤为空白对照。浸提液在室温下可以放置 1 周，4下放置 1 个月或在-15 oC 下保存。6.3 测定 准确吸取浸出液 10.00 mL 放入硬质消煮管中，加入重铬酸钾标准溶液(试剂 3)5.00 mL、浓 H2SO4 5mL，加入少量的抗暴物质,在 170-180磷酸浴上煮沸 10min，冷却后用去离子水全部转移至 150mL 三角瓶中，总体积为 70mL 左右， 。加入 2 滴邻啡罗啉指示剂，用硫酸亚铁溶液(试剂 5)滴
24、定剩余的 K2Cr2O7。4.4 测定土壤含水量：称 5.00g 上述湿润土壤，放在铝盒中，在 105烘箱中烘 8h，然后称其干重。115、结果计算1.有机碳(Oc)的计算W(C) =（V 0-V1）c3ts 1000 /DW式中：W(C) 有机碳(Oc)质量分数，mgkg -1；V0 滴定空白样时所消耗的 FeSO4体积，mL；V1 滴定样品时所消耗的 FeSO4体积,mL；c FeSO 4溶液的浓度,molL -1；3 碳(1/4C)的毫摩尔质量，M(1/4C)=3mg/mmol；1000 转换为 kg 的系数；ts 分取倍数;DW 土壤的烘干质量，g。2.生物量碳（Bc）的计算W(C)=2.64Ec式中：W(C) 微生物量碳(Bc)质量分数，mgkg -1；Ec 薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差，mgkg -1；
