1、一、单重 Taqman 引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在 www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前 长度 ：1835（1830 之间最好、最常见） ，最长 37；太长淬灭效果不好。 TM 值 ：Primer Express 软件计算出来的 Tm 值在 6672之间（最常见6870） ，最好为 70，确保探针的 Tm 值要比引物的 Tm 值高出 510，GC 含量在 3080%（最好 40%70%） ，因此探针最好是富含 GC 的保守片段；（Primer Express：Do not expand the
2、Tm range by more than 2 C from the default range） 。 探针位置 ：尽可能地靠近上游引物,上游引物的 3 端离探针的 5 端为 1-20bp（一般 10 个以内） ，最好是探针的 5端离上游引物的 3 有 1 个碱基。 5端应避免使用碱基 G，5 G 会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；如果选择 FAM-dye 在 5端第二个序也能为 G（G in the second position on the 5 end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized
3、 reporter signal） 。 可选：整条探针中，碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量，G 的含量多于 C 会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为 A 或 T。 Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4 个或超过 4 个的 G 碱基出现，即 3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, ther
4、e must be fewer than four consecutive G residues.） ；b. 避免连续的 6 个 A 出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal） ；c. 避免探针的中间区域含有 2 个或以上的 CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides i
5、n the middle of the probe, which can sometimes reduce signal） 。 检测探针的 DNA 折叠和二级结构 （最大连续的碱基配对数 =4：Maximum number of consecutive base pairings allowed in a primer=4；最大的总的碱基配对数=8： Maximum number of base pairings allowed in a primer=8）：a. 避免自身形成环状发卡结构（Hairpin Loops：If a DNA strand possesses a self-compl
6、ementary sequence, it may form a secondary structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must compete against the complementary strand for binding to the target se
7、quence, which reduces PCR efficiency.） ，b. 避免自身二聚体形成（Self-Dimers：Primers or probes that possess 3 complementarity with themselves in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a self-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may
8、add ambiguity to the PCR results. The Primer Express software calculates and eliminates from consideration most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong self-dimer tendencies.） ，c. 避免交叉二聚体形成（Cross-Dimers：Primers or probes that possess 3 complementarity with themselves
9、or another primer or probe in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a cross-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the PCR results. The Primer Express software calculates and eliminates from considera
10、tion most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong dimer tendencies.） 。 可选 ：3 端的淬灭基团也可以标记在探针的内部核酸上。5 端染料最好连接在T 或 C 碱基上。 可选 ：探针应高度纯化（HPLC） ；探针储存液应为 100um 浓度，工作液为10um 浓度并分装 25ul/份。 反应体系中探针浓度的优化主要依靠背景信号强度、探针与靶的结合效率、PCR 扩增的效率、引物的浓度等进行优化。一般探针浓度在 0.10.4uM 范围内进行优化。若用新合成的探针进行优
11、化时，一般从 0.2uM 开始对探针进行优化。目的是既使背景荧光最小化，又没有降低实验的敏感性，从而得到最佳实验结果。Smart cycler II的荧光背景信号应低于 500 个荧光单位，若高于 500，说明探针的商家对探针的纯化不好，或探针加的太多，或探针降解。2、引物：在探针确定以后再选择引物 长度 ：1830（1825 之间最好、最常见） ，最长 35，最佳 20bp；两条引物长度相差最好不超过 4bp（Tm of both primers should be close to each other to easily achieve an optimal annealing temp
12、erature） 。 TM 值 ：Primer Express 软件计算出来的 Tm 值在 5662（最常见 5860，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为 60，在这个温度下，5 核酸外切酶的活性最高） ，最佳 59，GC 含量在 3080%（最好 40%60%） ；上下游引物之间的 Tm 相差避免超过 2，最好相差 0.5以内。 （Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 C from the default range） 。 Repeating oligonucleotides：避免同一碱基重复过多，特别是
13、 G，不可超过 4个及以上，即3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.） 。 3 end：引物的 3 端最好不为 GC（即：Primer 3 GC Clamp Residues=0，以免错误引发） ；3 端的 5 个碱基中 G+C 碱基的总数不能超过 2 个（Make sure the last five nucleotides at the 3 end contain no more than two
14、G + C residues） 。可选：3 端避免使用碱基 A；3 端避免出现 3 个或 3 个以上连续相同的碱基。 引物 DNA 折叠和二级结构 （最大连续的碱基配对数=4：Maximum number of consecutive base pairings allowed in a primer=4；最大的总的碱基配对数=8：Maximum number of base pairings allowed in a primer=8）：a. 避免引物自身形成环状发卡结构（Hairpin Loops：If a DNA strand possesses a self-complementary
15、 sequence, it may form a secondary structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must compete against the complementary strand for binding to the target sequence,
16、which reduces PCR efficiency） ，b. 避免引物自身二聚体形成（Self-Dimers：Primers or probes that possess 3 complementarity with themselves in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a self-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add amb
17、iguity to the PCR results. The Primer Express software calculates and eliminates from consideration most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong self-dimer tendencies.） ，c. 避免交叉二聚体形成（Cross-Dimers ：Primers or probes that possess 3 complementarity with themselves or ano
18、ther primer or probe in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a cross-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the PCR results. The Primer Express software calculates and eliminates from consideration m
19、ost of the primers and probes that are self-complementary or possess strong dimer tendencies.） 。注意：引物二聚体绝对值超过4.5kcal/mol 易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行)；不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的 Tm 值非常之高。 最好能够设计多对引物与设计好的探针相匹配，来测试哪对引物最适合。选择能够给出最低 Ct 值，但是却能给出最高反应终点荧光值的引物。 引物浓度可以在 0.1uM1.0uM 范围能进行优化，最佳的引物浓度是0.2
20、uM0.5uM3、扩增子：Primer Express：Do not set higher than 300 base pairs 50200（70150 之间最常用，这个范围有最佳的扩增效率） ，最长不可超过300。扩增片段越短，有效的扩增反应就越轻易获得，较短的扩增片断也轻易保证分析的一致性。 扩增子 GC 含量在 4055%最好。 扩增值最大 Tm 值 85。二、多重 Taqman 引物探针设计（用一样的引物和探针设计原则设计 ）：1、探针： 除单重应注意的问题外，多重实时 PCR 的荧光探针应为同一类型，如同时为Taqman 探针：CY5-BHQ3， Texas Red-BHQ2，FA
21、M-BHQ1。 探针之间不能互相干扰。2、引物： 除单重应注意的问题外，不同靶引物对之间 Tm 值要接近，差控制在 5以内；引物长度最好在 2025bp 之间。 引物之间不能互相干扰，引物二聚体也要避免。 每对引物的靶序列是保守的、唯一的。 每对引物的浓度要调整，以使每个扩增子的指数增长期的扩增率相同。3、扩增子：除单重应注意的问题外，最好每重扩增相同长度的目的片段（目的片段最好100150bp） ，但长度不应相差太大。4、其它： 多重和单重平行进行并分析，以阐明多重与单重是否有区别（期望没有区别）：如敏感性，检测限，扩增效率。但是无论多重还是单重都只能含有被测的那个目的DNA 模板，而不含其
22、它的目的 DNA。 优化各引物和探针的浓度 荧光染料及淬灭物选择：淬灭基团种类 荧光报告基团种类DABCYL 6-FAM，TET，JOE，HEX，Cy3 等TAMRA 6-FAM，TET，JOE，HEX 等BHQ1 6-FAM，TET，Cy3，JOE，HEX 等BHQ2 Cy3，Texas Red，Cy5，TAMRA， ROX 等BHQ3 Cy5，Cy5.5 等 要保证多重 PCR 每一个扩增子的扩增效率相同（ For the successful multiplex reactions, you need to keep your amplicon PCR effciency at same level otherwise quantification of your amplicons cannot be compared） 。 不加探针的常规 PCR 反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件。 每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔，平行样的 Ct 值之间的差0.5。标准曲线斜率的绝对值接近 3.322，R 2 接近 1，通常标准曲线由 45 个点组成，模板浓度分别为 107/ml、10 6/ml、10 5/ml、10 4/ml、10 3/ml。
