蓝白斑实验汇总.doc

1、什么是蓝/白斑筛选，怎么进行蓝/ 白斑筛选载体 pGEMZ 在 -半乳糖苷酶（lacZ）的 -肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使 -肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的 -半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉 lacZM15 基因，导致内源 -肽失活。载体 pGEMZ 或其它含 lacZ 基因的-肽互补细菌，具有 -半乳糖苷酶的 片段，所得功能 -半乳糖苷酶（-肽加 片段）将底物 X-Gal 转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体 pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致 -肽编码区的破坏，使 -半乳糖苷酶失活，得到白色菌落

2、。-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因 -半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109， DH5） ，然后涂布到含 0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal 指示平板上。可将 50ul 的 X-Gal 和 100 ulIPTG 贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在 37oC 保温 30 分钟使液体扩散。IPTG 溶于水中，贮液浓度为 100mM，X- Gal 溶于 DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG 和 X- Gal 需分装后保存在-20 oC，可保存 2-4 个月。蓝白斑选择原理： Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indoly

3、l-b-D-galactoside ）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物； b-半乳糖苷酶与 Xgal 显色反应是通过 b-半乳糖苷酶能把无色的化合物 Xgal 分解成半乳糖和一个深蓝色的物质 5-溴-4-氯靛蓝； lacZ 的 a 肽互补：a- 肽（ lacZ ）是 b-半乳糖苷酶 N 端的一段氨基酸片断（11-41 氨基酸） ，lacZ 只有在 a-肽形成 4 聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ 突变（lacZ?M15） ，b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失 a 肽） ，不能形成 4 聚体的活性酶，不能分解 Xgal 。如受体菌株 JM 系列、TG1、TG2、XL1-blue、X

4、S127、XS101、KK2186、MV1184 、DH5a 等。而 pUC 质粒载体上的 lacZ 编码 a 肽与这个缺失突变的 b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成 4 聚体的 a-肽，故能分解 Xgal。产生蓝色物质。 a 互补的插入失活：pUC 载体上 LacZ的 5端有一段多克隆位点 (MCS)区，本身虽不干扰 LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ的合成。不能互补。 IPTG 的诱导作用：IPTG 是乳糖的类似物。能诱导 lac 操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的 lacZ 的 C 端部分和载体的 lacZa 肽都表达。从而互补。但载体 MCS 上插入外源 DNA 后，仍

5、然不能产生 a 肽。 IPTG 诱导的结果：MCS 无插入时，互补，蓝菌斑， MCS 有插入时，不互补，白菌斑（见下图） 。异丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D- 半乳糖苷（X-gal） 可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物 X-gal 还可充作生色剂，被 -半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色你的空载提转进去的话，IPTG 诱导 lacZ 表达 肽，互补体内缺陷的酶，然后可降解底物 X-gal，产生蓝斑；如果你则载体的多克隆位点插入了片段，导致编码的 肽错误

6、，或者不能编码 肽，也就不能产生正常功能的酶，无法分解 X-gal，所以长白斑。 互补人 们 发 现 lacZ 基 因 的 突 变 体 M15 质 粒 （ 缺 失 氨 基 酸 残 基 11 到 41） 是 没 有野 生 型 lacZ 基 因 产 物 那 种 分 解 X-gal 能 力 的 。 但 如 果 在 M15 突 变 体 的 抽 取物 中 加 入 -半 乳 糖 苷 酶 的 第 3 至 第 92 氨 基 酸 残 基 的 肽 段 （ 肽 ） 则 能 恢复 M15 分 解 X-gal， 而 显 示 蓝 色 的 能 力 。 这 样 一 种 基 因 内 互 补 现 象 称 做 互 补 （ -com

7、plementation） 。 -互 补 是 指 lacZ 基 因 上 缺 失 近 操 纵 基 因 区 段 的 突 变 体 与 带 有 完 整 的近 操 纵 基 因 区 段 的 -半 乳 糖 苷 酶 （ -galactosidase ， 由 1024 个 氨基 酸 组 成 ） 阴 性 的 突 变 体 之 间 实 现 互 补 。 -互 补 是 基 于 在 两 个 不 同 的 缺 陷 -半 乳 糖 苷 酶 之 间 可 实 现 功 能 互 补 而 建 立 的 。 大 肠 杆 菌 的 乳 糖 lac 操 纵子 中 的 lacZ 基 因 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 ， 如 果 lacZ 基 因 发 生

8、 突 变 ， 则 不能 合 成 有 活 性 的 -半 乳 糖 苷 酶 。 例 如 ， lacZ M15 基 因 是 缺 失 了 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 中 第 11-41 个 氨 基 酸 的 lacZ 基 因 ， 无 酶 学 活 性 。 对 于 只编 码 N-端 140 个 氨 基 酸 的 lacZ 基 因 （ 称 为 lacZ） ， 其 产 物 也 没 有酶 学 活 性 。 但 这 两 个 无 酶 学 活 性 的 产 物 混 合 在 一 起 时 ， 可 恢 复 -半 乳 糖苷 酶 的 活 性 ， 实 现 基 因 内 互 补 。 在 lacZ 编 码 区 上 游 插 入 一 小 段 DN

9、A 片 段 （ 如 51 个 碱 基 对 的 多 克隆 位 点 ） ， 不 影 响 -半 乳 糖 苷 酶 的 功 能 内 互 补 。 但 是 ， 若 在 该 DNA 小片 段 中 再 插 入 一 个 片 段 ， 将 几 乎 不 可 避 免 地 导 致 产 生 无 -互 补 能 力 的 -半 乳 糖 苷 酶 片 段 。 利 用 这 一 互 补 性 质 ， 可 用 于 筛 选 在 载 体 上 插 入 了 外 源片 段 的 重 组 质 粒 。 在 相 应 的 载 体 系 统 中 ， lacZ M15 放 在 F 质 粒 上 , 随宿 主 传 代 ； lacZ 放 在 载 体 上 , 作 为 筛 选

10、标 记 。 相 应 的 受 体 菌 有 JM 系列 、 TG1 和 XL1-Blue ， 前 二 者 均 带 有 D （ lac - proAB） F proAB + lacIq lacZD M15 基 因 型 。 其 中 lacI 为 lac 阻 抑 物 的 编 码 基 因 ，lacIq 突 变 使 阻 抑 物 产 量 增 加 ， 防 止 lacZ 基 因 渗 漏 表 达 。 lacZ 基 因 是 乳 糖 lac 操 纵 子 中 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 的 基 因 ， 乳 糖 及其 衍 生 物 可 诱 导 其 表 达 。 乳 糖 既 是 lac 操 纵 子 的 诱 导 物 ， 也 是 作 用 的 底物 。 异 丙 基 - -D- 硫 代 半 乳 糖 苷 （ IPTG） 是 乳 糖 的 衍 生 物 ， 可 作 为 lac 操 纵 子 的 诱 导 物 ， 但 不 能 作 为 反 应 的 底 物 ； 5-溴 -4-氯 -3-吲 哚 - -D-半 乳糖 苷 （ X-gal） 可 作 为 lac 操 纵 子 的 底 物 ， 但 不 能 作 为 诱 导 物 。 底 物 X-gal 还 可 充 作 生 色 剂 ， 被 -半 乳 糖 苷 酶 分 解 后 可 产 生 兰 色 产 物 ， 可 使 菌 落或 噬 菌 斑 呈 兰 色