1、侵袭小室实验摘要：在 A549 细胞中过表达 human Oct-4 基因，通过对 Oct-4 过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究 Oct-4 基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示 Oct-4 基因可以促进 A549 细胞的迁移能力。为进一步深入研究 Oct-4 基因的功能提供实验数据。关键词：Oct-4，Transwell， A549，细胞迁移一、 实验原理 Transwell 小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用 Transwe
2、ll 可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用 8.0、12.0m 膜，上室种肿瘤细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。二、 实验目的 用质粒 Oct-4-EGFP 转染后的 A5
3、49 细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析，考察基因 Oct-4 对 A549 细胞的迁移能力产生的影响。三、 实验步骤 实验共分以下 4 个主要步骤：1. 质粒转染细胞：准备 A549 细胞，转染前一天按照 70-80%密度铺在 6cm 培养皿中。16h 后，按照转染试剂说明书转染细胞（8g 质粒，20l lipofectamine 2000 转染试剂） 。2. Transwell 铺板；a) 转染 12h 后，胰酶消化，收集细胞： 细胞计数后，每个样品准备 1106 cells/mL。b) 1,200rpm5min 离心后，重悬浮于 1mL 无血清培养基。c) 湿润小室： 将 300L
4、 预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置 12h，将 ECM 膜湿润d) 将小室中的培养基去掉，24 孔板中，没有小室的孔中加入 500L 含 10%血清的培养基e) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡f) 每个样品取 300L，加入到小室中，即 3105 cells 加入到小室中，37，5% CO2 培养箱中培养3. 细胞培养及染色；a) 培养箱中培养 72h 后，取出小室b) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉c) 24 孔板中，没有小室的孔中滴入 15 滴染色液（约 500L）d) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡e) 常温放置 20mi
5、n，进行染色f) 用去离子水洗 3-5 次，将背景洗掉g) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干4. 统计分析。显微镜下拍照，使用 Image-Pro Plus 软件进行细胞计数。四、 实验结果 图 1. 过表达 Oct-4 对 A549 细胞迁移能力的影响从左开始依次为 A549 空细胞组，NC 对照组（过表达 EGFP），实验组（过表达 Oct-4-EGFP），每组实验均重复 3 次图 2. 过表达 Oct-4 对 A549 细胞迁移能力影响的统计分析*表示 p0.01结论：从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现，A549 细胞在过表达 Oct-4-GFP 72h 以
6、后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（p0.01）。五、 参考文献 1. Koch KR, Zhang CO, Kaczmarek P, Barchi J Jr, Guo L, Shahjee HM, Keay S. The effect of a novel frizzled 8-related antiproliferative factor on in vitro carcinoma and melanoma cell proliferation and invasion. Invest New Drugs. 2012 Oct;30(5):1849-64.、2. Carmona FJ,
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