1、Transwell 侵袭实验1.实验前一天将 ECM 胶(8-12 mg/ml ) (Sigma )放于 4冰箱中融化过夜2.实验时将所用的枪头在冰上预冷半个小时,ECM 胶用预冷的无血清 1640 按1:9 稀释(稀释至 1mg/ml) ,每孔中加入稀释好的 ECM 胶 40l ,放入 37培养箱中,孵育 5h3.水化基底膜:吸出小室中残余液体,每孔加入 70ul 含无血清 1640 培养液,37,30min,吸去培养基4.对数生长期的细胞,胰酶消化细胞,0.1%血清 1640 悬浮,计数,稀释至密度为 1106/ml,每空中加 200l细胞悬液5.24 孔板下室一般加入 600l 含 30
2、%新生牛血清的 1640 培养基6.24h 后,弃去孔中培液,PBS 洗 2 遍,甲醇固定 20 分钟,0.1%结晶紫染色15-20 min,用清水洗 3 遍以上,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞7.400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数个人觉得做 Transwell 就像小马过河一样,要讲究个体化,不同的细胞侵袭能力不同,胶的稀释倍数、细胞上样量、上下室血清浓度差以及孵育时间也不同。对于你的问题,我觉的不管是在温箱中放 5 个小时或者是在超静工作台中风干,其主要目的是为了让 Matrigel 从液体状变成胶冻状,在温箱中放置 5 个小时后,拿出来上室中肯定会有液体残留,此时一定要将残留的液
3、体洗干净,然后在水化一下基底膜。(1) 吸去培养液,用棉签轻轻擦除上室聚碳酸酯膜内侧面贴壁细胞,用0.01MPBS漂洗两次,4%多聚甲醛固定 10 分钟;(2) 吸去固定液,将膜风干,每孔加 0.6ml 0.1%结晶紫染液,室温中放置 20 分钟;(3) 轻轻甩去染色液,用蒸馏水洗涤各孔,将上室取出,从聚碳酸酯膜内侧面用吸水纸吸干水分,自然干燥;(4) 测定前,将各实验组上室置入新的 24 孔板中,每孔加 0.6ml 33醋酸脱色,充分振荡,每组设定 5 复孔;同时设置调零孔(33醋酸) ;比色:每孔取脱色液 150l 加入 96 孔板中,在 570nm 处测定 OD 值。2步骤21 Tran
4、swell 小室制备211 无基质胶 Transwell 小室制备 包被基底膜(冰浴操作):用 50mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜的上室面。24 孔板每空 50-70uL:20uL Matrigel + 160uL DMEM/F-124风干,过夜。如果需要在下室面铺 FN 的话,可将 200ul 枪头的尖端剪掉,吸取 FN 均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成 0.5mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入 50ul 含 10g/LBSA 的无血清培养液,37,30min。另有 tia
5、njin_glioma 战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80l (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置 37 30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。212 有基质胶的 Transwell 小室制备Chemicon 公司的 ECM550 系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入 300l 预温的无血清培养基,室温下静置 1530min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。22 制备细胞悬液 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 1224h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 消化细胞,终止消化后离心
6、弃去培养液,用 PBS 洗 12 遍,用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 110105,个人认为不要超过 5105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。23 接种细胞
7、取细胞悬液 100200l 加入 Transwell 小室,不同公司的、不同大小的Transwell 小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。 24 孔板小室一般200l。 24 孔板下室一般加入 500l 含 FBS 或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 培养细胞:常规培养 1248h(主要依癌细胞侵袭能力而定) 。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数
8、目的影响也不可忽视。以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用 MTT 筛选出的 72h 的 IC50。用这个浓度处理细胞,24h 内对细胞增殖并无明显抑制,但 24h 后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做 Transwell,处理时间也必须限定在 24h 内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的 MMPs 储存,短时间内可能侵袭能
9、力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响 MMPs 表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后 12h 把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。
10、 24 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法:241 直接计数法2411 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。通过给细胞染色,可在镜下计数细胞 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 染色:常用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa 染色、苏木精染色、伊红染色等。个人推荐采用 0.1%结晶紫染色,这种方法有如下优势:(1). 不需要固定细胞,直接染色即可。(2). 配制简单方便。(3). 染色后可以用 33%醋酸脱色,将结晶紫完全洗脱下来,洗脱液可在酶标仪上 570nm 测其 OD 值,间接反映细胞数。个人认为这是结晶紫染色最大的优势所
11、在。因为,虽然经过准确的细胞计数,往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制,可能某一批实验穿过的细胞会特别多,以致细胞成堆,这种情况下就难以计数了,这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测。使用结晶紫染色要注意,染色前要将膜风干,否则可能会染不上。 细胞计数:我们使用的是 Leica DC 300F 正置显微镜进行观察和拍照,把Transwell 小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色,再贴在玻片上,滴二甲苯,再盖上盖玻片,就可以长期保存,但是这样做小室就成了一次性的了,未免有点浪费。取若干个视野计数细胞个数。论坛里一般采用 35 个视野,也有人用 1
12、0 个,都是随机选取,个人认为这样选择的视野带有很大的偶然性,也会掺进人为影响,特别是计数视野较少的时候。我选取 16 个视野,不是随机选择,而是有固定的位置。我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是 Chemicon 公司的ECM550 系列小室底面膜的直径的 1/4。不同厂家不同型号的小室,膜的面积不尽相同,但个人认为,拍照时还是应当选取固定的位置,并选择尽可能多的视野。2412 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系,有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上,而是掉进下室。这种情况我没有遇到过,根据论坛里提供的经验,可以收集下层培养液,用流式细胞仪计数细胞量,也可用细胞计数的方法
13、直接在镜下计数,个人认为 MTT 应该也是可以用的,有兴趣的可以试试看。 241 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多,而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法,与常用的 MTT 实验是同样的原理。2411 MTT 法 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞 24 孔板中加入 500l 含 0.5mg/ml MTT 的完全培养基,将小室置于其中,使膜浸没在培养基中,37 4h 后取出。 24 孔板中加入 500l DMSO,将小室置于其中,使膜浸没在 DMSO 中,振荡 10min,使甲臜充分溶解。取出小室,24 孔板于酶标仪上测 OD 值。2411 荧光试剂检测这类方法一般是与 Transwell 小室一起出售的,其原理与 MTT 法类似,是用一种荧光染料染细胞,再将细胞裂解,检测荧光值。Chemicon 的 ECM554 即属于这类。2411 结晶紫检测上文已说过,这里不再赘述,原理与 MTT 法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点,就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞,在脱色后还可重新染色。