1、胶质瘤细胞的体外培养1 实验材料1.1 细胞株胶质瘤细胞 U251MG, U87MG（购自上海细胞库，本室保存） 。1.2 主要试剂DMEM 培养液 GIBCO 公司胎牛血清 Hyclone 公司硫酸链霉素 大连美罗药业有限公司青霉素 山东鲁抗制药有限公司PBS 磷酸盐缓冲液 福州迈新生物技术有限公司胰蛋白酶 Sigma 公司EDTA Sigma 公司DMSO Sigma 公司L-谷氨酰胺 Sigma 公司NaHCO3 北京化学试剂公司其余试剂均为国产分析纯。 1.3 主要仪器超净工作台（SW-CJ-IF） 苏州安泰空气技术有限公司CO2培养箱（spx-300B-） 上海跃进医疗器械厂全自动荧
2、光倒置显微镜 Olympus 公司台式高速冷冻离心机（3K15） Sigma 公司小型台式离心机（I-14） Sigma 公司DKB-501A 型超级恒温水槽 上海精密实验设备有限公司精密电子天平（JJ200） 常熟双杰测试仪器厂液氮罐 成都金凤公司血细胞计数板 江苏海门市天龙实验器材厂2 实验方法2.1 常用设备的消毒2.1.1 玻璃器皿的消毒 浸泡：将玻璃器皿浸入含有去污剂的水中，让水完全进入瓶皿，不要产生气泡，浸泡过夜。 刷洗：用软毛刷轻轻刷洗，不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。自来水冲干净后晾干。 泡酸：器皿在酸缸中浸泡过夜，浸泡时让器皿充满酸液，勿留气泡。 冲洗：将器皿从酸缸中
3、捞出，用自来水冲洗 10 次，流水冲洗过夜，晾干。蒸馏水漂洗 3 次，烤箱内烤干。 消毒：用锡箔纸包装甁皿，高压蒸汽消毒 30min，烤箱内烤干。2.1.2 金属器械的消毒 先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包好，高压蒸汽消毒 30min，烘干备用。2.1.3 橡胶的消毒 胶塞先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，晾干后装入铝盒内高压消毒 30min，烘干备用。胶头用 75酒精浸泡 5 分钟，紫外照射后使用即可。2.2 细胞培养2.2.1 实验前准备 75酒精棉球擦拭超净工作台，将装有玻璃器皿和器械
4、的铝盒、胶头、酒精灯用酒精消毒后在超净台内合理摆放，紫外线照射30min。从培养箱内取出细胞，注意旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。水浴锅预热至 37，培养液、PBS 液和胰蛋白酶置入水浴锅内复温。取出完全复温的培养液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。点燃酒精灯，火焰不能太小。2.2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速将其置 37水浴，不断摇动，使其快速解冻。 待细胞冻存管内液体完全溶解，将细胞冻存管用 75%酒精棉球擦拭，置超净台内。 将细胞冻存管液体移入 15ml 离心管，加 5ml DMEM 培养液（含 10% FBS） ，混匀， 1000rpm，离心
5、 5min。 弃上清液，加 2ml 培养液混匀细胞后，移入 25mm2 培养瓶，再添加适量培养液，于 37、5%CO 2、饱和湿度培养箱中培养。2.2.3 细胞传代 小心吸除培养瓶内旧培养液，PBS 清洗 2 次。加入适量的含0.25%胰酶消化液，以能覆盖细胞为宜。 消化 2 5min 后，显微镜下观察细胞，发现细胞质回缩、细胞间隙变大、连接松散时，立即加入含血清的 DMEM 液终止消化。 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，确保所有瓶底都被吹到，吹打时轻柔，尽可能不要出现泡沫，制备成单细胞悬液。 将细胞悬液吸至 15ml 离心管中，1000rpm 离心
6、3min。去除上清液，加入 45ml 培养液充分混匀，制成单细胞悬液。 倒置显微镜下计数细胞，传代细胞的密度不应低于5105/ml。细胞计数流程： 将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室加盖专用的盖玻片。 用移液器吸取细胞悬液 20l 沿盖玻片边缘缓缓滴入，不要溢出盖玻片，也不要让悬液流入旁边槽中，不能产生气泡。 显微镜下，统计计数板四个大格的细胞数（对于压线的细胞只计算在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数） 计算细胞密度（细胞悬液的细胞数/ml（四个大格子细胞数/4 ）10 4稀释倍数/ml）, 对每个样品计数三次，取其平均值。 分装细胞悬液至两个或以上的培养瓶中，再加入适量培养液（以覆盖瓶底为宜） 。瓶子做好标记。 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，置于 37、5%CO2 饱和湿度条件培养箱中培养。2.2.4 细胞冻存 0.25%胰酶消化处于对数生长期的单层贴壁细胞，将消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。 弃去上清液，加入适量预冷的冻存液（血清 9 份 + DMSO 1 份，混匀后置于 4冰箱） ，调整冻存液中的细胞密度为5106110 7/ml。 用吸管轻轻吹打让细胞重悬，分装细胞悬液(1ml/管),旋紧冻存管管口，封口膜封严。冻存管上做好标记，写明细胞的名称、传代次数、冻存时间等信息。 细胞以下条件逐步冻存：4 30min-80过夜液氮长期保存。
