1、细胞培养的无菌环境、常用培养器皿及清洗消毒(2008-08-23 11:00:58)标签：细胞培养无菌环境常用培养器皿清洗消毒杂谈 细胞培养的无菌环境一、无菌室 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（12h），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2h）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。 此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间
2、；等。 二、超净工作台 工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。 超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48m/s为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射1030min，然后让超净台预工作1015min，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。 常用培养器皿及清洗消毒 细
3、胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。 一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。 （一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4个步骤。 1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备
4、刷洗。 2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。 3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于6h，一般过夜或更长。放取器皿要小心。 4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗23次，晾干或烘干后包装备用。 （二）橡胶制品清洗 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，
5、流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20min，50烤干备用。 （三）塑料制品的清洗 塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。 清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（1520遍）,蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。 （四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，
6、较大的器皿可以进行局部包扎。二、消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因 （一）物理消毒法 1.紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。 紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2m的30W灯可照射9平方米房间，每天照射23h，期间可间隔3
7、0min。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5m照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5m，照射时间30min为宜。 紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。 2.高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。 不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易
8、为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。 3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160以上，并保持90120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。 干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。 烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。 4.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生
9、物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。 （二）化学消毒：新洁而灭，其0.1水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。 （三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。 可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、
10、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。细胞培养时的无菌操作及工作常规一、无菌操作1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射3060分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、
11、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验人员用0.1%过氧乙酸水泡手，擦干。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、点燃酒精灯，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。水平式风机的超净台，容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，应尽量避免瓶口敞开直立。使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。同一根吸管或滴管不应连续
12、用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣、手套和帽子后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少 ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5、定期检测下列项目：CO2钢瓶之CO2压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之 air flo
13、w压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。二、实验用品1、种类：细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates，dishes，rollerbottle等，依实验需要使用。 plastics terile pipet:1ml，2ml，5ml，10ml，25ml。塑料离心管:15ml，50ml，均有2种不同材质，其中polypropy
14、lene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 glass pastuer pipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。玻璃血清瓶 (PyrexorDuranglassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。三、清洗1、玻璃器皿的清洗一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新购玻璃瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（0.10.05N HCl
15、）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿，用后要立即完全浸入水中，不能留有气泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗后的玻璃器皿要用鼓风干燥箱干燥。（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6 小时。 清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 631000
16、200000 （B）次强清洗液 1202001000 （C）弱清洁液 100100100。清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。（4）冲洗：浸酸后必须用水充分冲洗。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净（流水过夜），然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用（用鼓风干燥箱干燥）。2、胶塞的清洗细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是
17、：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH煮沸1020 分钟。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸1020 分钟，晾干备用。3、金属用品的清洗先用自来水反复刷洗或冲洗，然后用蒸馏水浸泡。四、灭菌1、实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121，15lb，20分钟，置于oven中烘干。2、实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170，4小时。3、液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121，15lb，20分钟处理。体外细胞培养一般过程(2008-08-23 09:24:57)标签：细胞培养细胞分化体
18、内外细胞差异培养方法杂谈 体外培养的概念 体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 体内、外细胞的差异和分化 1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱
19、；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，
20、这些均属于细胞分化行为。 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（
21、尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培
22、养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Imm
23、ortality）而无恶性。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度196，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 五、常用仪器设备 无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,
24、培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。细胞培养常见问题及解决方法（时间:2008-12-12 14:41:48）问题1：培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。(2)松开瓶盖1/4圈。(3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。(4)在
25、CO2培养环境中改用基于Earles盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。(2)将培养液加热到37，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。问题4：培养细胞不贴壁 可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(N
26、aHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当(6)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。(2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液(6)启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度 问题5：悬浮细胞成簇 可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建
27、议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。(2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。(3)用DNase I处理细胞。 问题6：原代细胞培养物污染 可能原因原代培养组织在进入培养前已污染 建议解决方法培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。 问题7：培养细胞生长减慢可能原因(1)由于更换不同培养液或血清(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。(3)培养物中有少量细菌或真菌污染(4)试剂保存不当(5)接种细胞起始浓度太低(6)细胞已老化(7)支原体污染建议解决方法(1)比较新培养液与原培养液成分，比较新血清
28、与旧血清支持细胞生长实验。让细胞逐渐适应新培养液。(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。(4)血清需保存在-5到-20。培养液需在2-8避光保存。含血清完全培养液在2-8保存，并在2周内用完。(5)增加接种细胞起始浓度。(6)换用新的保种细胞。(7)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 问题8：培养细胞死亡 可能原因(1)培养箱内无CO2(2)培养箱内温度波动太大(3)细胞冻存或复苏过程中损伤(4)培养液渗透压不正确(5)培养液种有毒代谢产物堆积(6)更多原因参考问题4和问题7
29、 建议解决方法(1)检测培养箱内CO2(2)检查培养箱内温度(3)取新的保存细胞种(4)检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260 350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。(5)换入新鲜培养液(6)更多解决方法参考问题4和问题7组织细胞培养技术2008-04-14 22:42分类：细胞、组织培养 字号： 大大 中中 小小 一、组织培养的基本概念Tissue culture: 从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。体外培养 细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开
30、发与基础研究(1) 新药筛选：(2) 疫苗研究与开发： (3) 基因工程药物研究与开发： (4) 细胞工程药物研究与开发： (5) 单克隆抗体制备： 药物作用机理 基因功能(7) 疾病发生机理2、 生物制药(1) 疫苗生产： (2) 基因工程药物生产： (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：对组织培养的评价优点：1、直接观察活细胞的形态结构和生命活动。2、便于用各种不同技术方法研究细胞。3、培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，广泛用于分子生物学和基因工程研究。4、同时提供大量的生物学性状相似的实验对象。不足：利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞一样。组织培养的发
31、展简史1、早期组织培养: Roux（1885） 用温NS培养鸡胚。Jolly(1903)用盖片悬滴法培养蝾螈白细胞。Beebe and Ewing(1906)培养狗淋巴细胞。2、现代组织培养：Harrison(1907) and Carrel(1912)开始， Harrison培养蛙胚神经组织。 Carrel培养了鸡胚心肌组织。3 从50年代起，组织培养技术快速发展。试管培养 组织培养细胞生物学一、体内外细胞的差异 “反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。二、培养细胞的分化1、不适应（dea
32、daption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）2、脱分化或去分化（Dedifferentiation):细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉储存肝糖原能力）培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子。培养细胞的形态分类分为贴附型和悬浮型两大类（一）贴附型 1、成纤维型细胞：心肌细胞、平滑肌、血管内皮细胞等2、上皮型细胞 3、游走型细胞4、多形型细胞培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期：原代培养期传代期 衰退期原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到
33、第一次传代阶段。细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。细胞独立生存性差。传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。这一过程称为传代。否则将影响细胞的继续生存。细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。无限细胞系： 细胞获永久性增殖能力。核型大多变成异倍体。克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群.（二）组织培养细胞一代生存期1、潜伏期（Latent pha
34、se) :细胞从悬浮状态贴附于底物表面上。原代培养细胞贴附慢 （10-24 h）。连续细胞系贴附快（10-30 min)。细胞贴附受多种因素影响（1）支持物：底物表面要清洁， 底物表面有阳性电荷有利于细胞贴壁。（2）一些特殊物质的存在：血清2 指数增生期：细胞增殖最旺盛，细胞分裂相增多。是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好和最主要的阶段。持续3-5天。细胞分裂指数（Mitotic Index, MI)：细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.3、停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖。培养细胞生存环境、条件和代谢一、无污染环境二、温度：三、气体环境和pH四、培养细胞生存所需基本物质
35、1、糖 2、氨基酸 3、各种维生素4、促生长因子* ：血清*5、其他物质 五、渗透压培养基*合成培养基（Synthetic Medium)天然培养基（Natural Medium)血清，以牛血清和马血清为最常用。血清内含有多种促细胞生长因子，促贴壁因子及其它活性物质等。一般需加10%-20%。附着底物：1、玻璃2、一次性聚氯乙烯材料3、饲细胞（Feeder cell)用成纤维细胞或其他细胞长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力但尚存活和有代谢功能。将特殊难培养的细胞接种于其上。体外培养细胞成功率分析成功的关键:培养物必须贴附在底物上细胞生长和增殖一、组织和细胞的供体年龄二、培养条件
36、三、贴附底物四、培养方法：酶消化分离组织培养设施和基本条件实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌。操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。常用设施及设备 （1）超净工作台：。（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。（3）操作间：普通培养箱、离心机、水
37、浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。培养器皿常用的器皿有下面几种。（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml。（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm（4）培养板培养用液平衡盐溶液（Balanced Salt Solution,BSS)天然培养基(Natural Medium)合成培养
38、基(Synthetic Medium)Hanks 平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt Solutions，HBSS）成分 含量（g/L）CaCl2 (无水氯化钙) 0.14KCl 0.40KH2PO4 0.06MgCl26H2O 0.10MgSO47H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01钙镁有促使细胞凝聚作用,配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时,宜采用D-Hanks 天然培养基血清 细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小
39、牛血清热灭活是指56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量合成培养基一、种类RPMI1640：适用于很多细胞的生长，特别是血液细胞。DMEM（Dulbeccominimum essential medium) (高糖和低糖）低糖对肿瘤细胞有力。HamF12 和Mc-Coy5A 多用于难培养的细胞。合成培养基的成分：1、氨基酸 2、碳水化合物 3、维生素 4、无机离子 5其它成分：在杂交瘤技术中，常在DMEM培养基中加入
40、2-巯基乙醇（2-Me). 2-Me对细胞的生长有非常重要的作用，能诱导细胞增殖。常配成0.1M储存液，用时每升培养液加0.5ml.培养液的配制1、玻璃三蒸馏水2、把干粉加入温（15-30度）水中，搅拌使其溶解；3、加NaHCO3;4、加水至终量5、用0.22 mm微孔滤膜滤过消毒。其它常用液消化液：分离组织和分散细胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液。可以单独使用，也可以混合使用。1）胰蛋白酶溶液胰蛋白酶（简称胰酶）是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。
41、一般来讲，胰酶浓度大、作用温度高、作用时间长，对细胞分离能力也大，但超过一定的限度会损伤细胞。胰酶溶液在pH8.0，温度为37时，作用能力最强。注意：钙离子、镁离子和血清蛋白的存在会降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks 平衡盐溶液配制成0.25%溶液。胰蛋白酶溶液配制：（1）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状，然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，并不断搅拌振荡；（2）次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为0.25% 或0.125%。胰
42、蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。保存条件：-20冰箱中，以免分解失效。EDTA4Na 溶液EDTA 是一种化学螯合剂，对细胞有一定的离觧作用，而且毒性小。常用工作液浓度为0.02%。通常与0.25%的胰蛋白酶溶液按1：1 混合使用（混合液）。注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长。EDTA 溶液配制：用无钙、镁的D-HBSS 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，室温或4冰箱保存。胰蛋白酶EDTA4Na 溶液（0.05%胰蛋白酶, 0.53mM EDTA4Na）0.5g 胰蛋白酶0.2gEDTA4N
43、a1L D-HBSS。-20冰箱中保存。pH 调整液（1）NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌，分装，4冰箱或室温保存。当pH 值超过后，可用高压灭菌的10醋酸溶液或通入CO2 气体方法调节。（2）HEPES（分子量238.31）溶液HEPES 使用终浓度一般为10-50 mM, 但通常配成1M 储存液：用200ml 双蒸水溶解47.6克HEPES，用1N NaOH 调节pH 至7.5-8.0;然后过滤除菌，分装小瓶，室温或4保存。抗生素溶液：青霉素 100单位/ml培养液链霉素 100 mg /ml培养液玻璃器皿的清洗 玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗
44、四个步骤（1）浸泡：需先用清水浸泡。然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6 小时。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种
45、： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 631000200000 （B）次强清洗液 1202001000 （C）弱清洁液 100100100。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发。清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸后都必须用水充分冲洗。胶塞的清洗细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20 分钟，晾干备用。塑料制品的清洗必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。消毒消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果
