1、细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。于此，我先代表广大细胞培养新手谢
2、谢各位园丁里的奉献者！有空整理一下再写写。 。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法）（一）仪器的清洗总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。 酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液）可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗 3-5 遍-超声波清洗 30- 烘干- 濅入清
3、洁液过夜（不少于 6h）-自来水冲洗1520 遍-蒸馏水洗 3-5 遍，烘干备用。不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干-2%NaOH 濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl 濅泡三min，流水冲洗-蒸馏水漂洗- 烘干备用。消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！每
4、个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！您的这个帖子属于改范畴！感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接 pm 我们！再次感谢！再多说点啊！呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。1、首先说清洗：对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡 24h 以上，再用清水浸泡 24h。之后用清水将移液管冲洗 10 遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗 3-5 遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌 20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次
5、强酸液（重铬酸钾 120g 浓硫酸 200 mL 蒸馏水 1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗 3-5 遍，再用双蒸水漂洗 3 次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌 20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、灭菌时保持密封。Tip 头就容易了，插到盒子里，双层牛皮纸包好后直接高压灭菌就好了。2、再说说除菌：我说的除菌主要是指溶液的除菌。如 PBS、HEPES 之类的一些缓冲剂和不含葡萄糖的盐溶液，可以配好以后直接高压灭菌。而大部分的溶液由于成分
6、限制必须过滤除菌。我们实验室需要过滤除菌的溶液有：胶原酶、胰酶、各类血清、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、各类生长因子、丙酮酸钠、谷氨酰胺等.3、关于各类溶液的配制：我列出我们实验室常用试剂的配方吧：1XPBS：氯化钠 8 克、氯化钾 0.2 克、磷酸二氢钠 1.15 克、磷酸氢二钾 0.2 克，加水至一升，调 pH=7.4。这里我认为 PBS 的 pH 是最重要的一环，不可大意。HEPES 溶液：8 克氯化钠、0.3 克氯化钾、0.135 克磷酸氢二钠、 1 克葡萄糖、5 克HEPES 加水 900ml，调 pH=7.4抗生素：我们主要用青霉素和链霉素，一般用 1XPBS 稀释至 1X
7、105 单位，-20 度储存，用时直接加入培养基，工作浓度一般为 1X102 单位。G-418：1 克包装的 G-418 瓶中加入 10mlHEPES 溶液彻底溶解，过滤除菌后分装于 EP管，-20 度保存。谷氨酰胺：L-谷氨酰胺 29.2 克，加 HanksBBS1000ml 溶解，配成 200mmol/L 过滤除菌，4 度保存，工作浓度 14mmol/L。加有谷氨酰胺的培养液在 4冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。1XEDTA-胰酶：0.25 克胰酶加 0.1 克 EDTA 完全溶解于 500ml 1XPBS 中，过滤除菌后分装于 50ml 离心管中，一管 4 度备用，其
8、他-20 度保存。我不太主张配成 10X 的母液，因为胰酶反复冻融后，效果会差很多。 （EDTA 很难溶，必要时候可放置过夜）MTT： sigma 公司出产，用 1XPBS 配成 50mg/ml 待用。MTT 毒性很大，配置时务必小心。各类培养基：现在我们实验室都是买 GIBICO 的粉剂自己配制。包装盒上会有配制方法，以及加碳酸氢钠的量。按说明来就是了。需要注意的是在配培养基前，最好先确保碳酸氢钠充分溶解，避免局部 pH 偏高或偏低。再一个就是水的使用，一般配盐溶液，用三蒸水即可，而配制培养基务必用超纯水，并在使用前要高压灭菌。今天太晚了，先说到这，明天继续 4、关于培养基的选用：我养过的细
9、胞株不多，权当抛砖引玉吧。一般来说大部分细胞系我们都用高糖 DMEM+10%FCS 培养，我们实验室用该培养基的有：HepG-2、NIH-3T3、A 549、Hela、C 2C12、COS-7。特殊的，如 P19Cl6 用 -MEM+10%FCS，SGC-7901 用 RPMI-1640+10%FCS，293 细胞则用 MEM+热灭活的马血清。对于贴壁不是很紧的细胞，用 45%DMEM+45%-MEM+10%FCS有奇效现附上前辈总结的帖子，希望对大家有帮助5、操作中的一些小细节：实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以 70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无
10、菌操作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 5 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作
11、实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。定期检测下列项目： CO2 钢瓶之 CO2 压力 、CO2 培养箱之 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换 )、无菌操作台内之 airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/ 预滤网，3000 小时/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。 水槽可添加饱和硫酸铜溶液，并定期换水。6、血清的相关问题：血清必须贮存于20，若存放于 4，不要超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将4045 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，预留此膨胀体积之空间
12、，以免容器冻裂。一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。瓶装(500ml) 血清一定要逐步解冻: 4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 )，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由 20直接至 37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活是指 56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。以我们实验室做的对照试验看，未
13、灭活血清效果的确要好些。细胞培养基的基本知识.doc (36.5k)good, 很有帮助，谢谢 7、贴壁细胞传代培养：一般步骤为：真空泵吸走培养基，1XPBS 漂洗两次，加入 1mlEDTA-Tripsin（100mm皿为例） ，37 度放置数分钟，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量血清，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，离心后加入新鲜培养基，按比例转移至新皿。细胞的传代最重要的是胰酶处理时间，若胰酶处理太久，容易造成细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。我谈谈个人经验：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901 几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理
14、5-6min， C2C12、COS-7 、NIH-3T3 比较容易脱落，2min 足矣，P19Cl6 和 293 细胞贴壁不紧，可在 PBS 漂洗后，直接换新鲜培养基打散。8、细胞冻存及复苏：首先说冻存液配方，常用的配方一般是两种90%FCS+10%DMSO 或 70%培养基+20%FCS+10%DMSO。前一种较贵，而且后一种冻存效果也不错，因此本人一般选用第二种配方。对于比较脆弱的细胞则选用前一种冻存液。冻存步骤比较简单，前期处理同细胞传代，只是在离心后是直接吸取上清，用手拍打离心管底部，加入适量冻存液使细胞完全悬浮后分装于冻存管。制后先将冻存管放入 4冰箱，约 40min。 接着置于 -
15、20冰箱，约 60min。置于-80 超低温冰箱中放置过夜。 最后置于液氮罐中长期保存。 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。注意事项：1使用 DMSO 前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。2冻存时要选处于对数生长期的细胞，这样效果要好很多 3不宜将冻存细胞放置在 0-60这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区 ”。 4注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 5冻存液中的培养基要与培养时相同，避免细胞由于环境突然改变而死亡，在冻存管上也要标明培养基种类。6冻存液不要预热。 7程序冻存
16、盒非常好用，省事省时效果还好，强烈推荐冻存使用冻存盒。细胞复苏的原则是快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至 37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体步骤：1.将水浴锅预热至 402.用 75酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。4.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。5.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。6.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。7.约 1-2min 后冻存管
17、内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，8.平衡后，放入离心机中 3000r/min 离心 3min9.吸弃上清液。10.向冻存管内加入 1ml 培养液，吹打制成细胞悬液。最后将细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 37和 5CO2 的培养箱内 12-24 小时后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。注意事项：1复苏时选用的培养基要符合冻存管上标明的培养基。2操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。3自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉不好意思,写错了 好东西，谢谢你的辛勤劳动。真空泵中间接一个 10000ml 的大烧瓶啊
18、 吸液的管子直接往烧瓶里漏，吸气的一头保证在液面以上就可以了那要看你用什么真空泵了.我们实验室用的水泵 ,不会大量产热 ,即使是空转也没有关系.单纯用电机抽真空肯定是不行的.细胞传代培养（消化法）具体操作：一. 传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS 液和胰蛋白酶的瓶子放入 37水浴锅内预热。2.用 75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用
19、液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS 清洗（冲洗） ，加入适量消化液（胰蛋白酶液） ，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是 37。2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。三.吹打分散细胞：1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞
20、悬液。2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10ml 离心管中。3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1000 转/ 分钟离心 6-8 分钟。4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。四.分装稀释细胞：1.分装：将细胞悬液吸出分装至 2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5105/ml。最后要做好标记。今天做亚细胞定位，突然想起一个细节问题：不知其他战友发现没有，有时候做定位时会发现有些细胞是在玻璃片的另一
21、面。这是因为细胞传代时，玻璃片没贴在底部，细胞就落在了培养皿底和玻璃片中间。这样一来就会影响到观察和拍照。我现在做亚细胞定位传代时，都会先在皿里滴两滴培养基，让玻璃片贴在底部后再将细胞悬液加进去，这就避免了以上现象。养细胞的准备工作耗费了我好长时间。1 、查资料总结需要的仪器设备（要找到型号、价格、购买途径） 、试剂（厂商、型号、规格、价格、购买途径） 、杂碎用品（价格、购买途径）2、联系厂商购货，大型仪器还要填报建设项目申请表，等待学校招标。3、着手建立实验室。缺少的东西还要和其他院系交流，争取合作。4、因本人是实验室第一个做细胞的，还要找到其他老师，帮他们做试验，同时学细胞培养的知识。MT
22、T 又是个细节问题极多的操作，做起来是需要一段时间摸索的。整个流程下来好累啊！其实,最好的方法就是借一本好的细胞培养书: 薛庆善和司徒镇强编的 都很好. 只有书上说的才是最详细的 ,很多东西可以知其然,并且知其所以然 .固然,从其他人那里可以得到一些知识,但是为什么如此,不如此会有什么结果,比如:刷瓶子有什么用?泡酸有什么用? 很多人只能够笼统的说灭菌,其实不尽然.当然,我的意思并不是说,知道这些很重要, 而是强调,从书上我们能够获得最详尽最直接的知识.当书上说得不具体时,则可以来这里问问各位战友,有的放矢,方为上策感谢上面的几位朋友的大力帮助,我也再次温习了一次很有帮助. 谢谢非常不错,让我
23、这个初学者受益匪浅!千言万语汇成一句话：太谢谢了。非常感谢你的辛勤劳动 ,受益匪浅我是个新手，现在正准备做试验。这些东西对我非常有用，谢谢大家！确实很不错哦，非常具体，受益匪浅，谢谢非常感谢,马上就开始做试验, 真是受益匪浅多谢各位前辈的总结，获益匪浅！大家都写的很多了，再补充一些关于试剂购买：一定要按 ATCC 或者细胞系构建者的建议使用相应的培养基，我试过用不同的，感觉培养出来的细胞形态有所不同，没有进一步检测其他指标。FBS 最好能用进口的，hyclone 或者 gibco 的都很好用。培养基使用一段时间后要注意酸碱度，我的经验用过一段时间后很容易偏碱，对细胞的生长还是有一些影响的。关于
24、培养箱中的水盘，忘了跟谁学的，在水盘里加入过饱和的 CuSO4 可以抑制霉菌的生长，我们一直在用，效果不错。另外有个问题想问一下，大家擦培养箱的时候用什么擦？我们以前一直用复合醛再用酒精，可是最近看一个实验室根本不怎么擦，顶多半年用酒精擦一次好像也没有什么问题？多谢各位前辈的总结，获益匪浅！培养箱每周一次 0.1%新洁尔灭或 75%酒精擦洗,但是我们实验室之前也很少这么做也不见有问题!我觉得还是擦洗一下别抱侥幸心理好. 太好了，多谢啊不错 不错 谢谢啊看了收益非浅，我要开始做后，也会把心得记录下来，和战友们进行交流。不过，目前我还是新手，希望大多指导哦！关注之中-受益匪浅啊谢谢啦没想到 今天进
25、这个板块 受益这么多 多谢诸位请教各位老师了 :我这两天配培养液,是 GIBC0 的DMEM/F12,根据以往的经验, 将一袋 DMEM/F12 溶于 1000 毫升水,约加入 2 至 3 克NAHCO3,调 PH 值 7.28 左右就可以了,可是我这次只加了 0.3 克,PH 值就 7.28 了,我很诧异,只好过滤了,结果第二天发现不管放在温箱里的三管培养液还是放在 -20冰箱里的培养液全变黄了.真是怪事,请大家分析以下怎么回事,是污染了还是怎么搞的,温箱里的三管培养液并不浑浊,就是很清亮的黄颜色 .操作不规范培养液该加多少 NaHCO3 是固定的看看说明书加少了，没有缓冲当然会变颜色您好,
26、我调 PPH 值到 7.28 了,怎么会没有缓冲呢 hho培养液不是这么配的.你没有说明书么? 上面有很标准、很正规的配置步骤呀附: DF12 说明书这个是 sigma 的不过大家都是一样的 .df12.pdf (51.39k)我们这里的去离子水偏酸,以前至少要加 2 克,1.2 克是做不成实验的.因为PH 值不对,我看了配置步骤,好象也没有错啊?是不是放-20冰箱里也会污染/NaHCO3 是起酸碱缓冲作用的，不是用来调节 PH 的（当然它也可以用来调 PH） 调节 PH 应该用NaOH 和 HCl.DF12 必须加 1.2g，这是肯定的加少了绝对不行，加多了也不对比如你这次应该先加 1.2g
27、NaHCO3，然后用 1M HCl 调节 PH加少了起不到缓冲作用，因为至少加 1.2 才能起到缓冲作用另外，变黄是由于缓冲不足呈酸性，而不是污染好奇怪,你复苏时候离心 3000RPM 会不会太大了,细胞都被甩破了 skinner:您好, 我今天在愤怒之中用 PH 试纸测定了 PH 不到 7,可见加少了确实起不到缓冲作用.现在只好重新滤过了. 谢谢您的指导啊 !大家再讨论一下NCSU23 吧，这个培养基的购买、使用，请介绍一下吧！学到了很多东西，谢谢！谢谢 我是新人正准备做细胞培养，太感谢了 xiexie 非常感谢各位前辈，有收获！正准备做海马细胞培养，学了不少啊。多谢。我要开始做细胞培养了，什么都不懂，看了各位前辈的心得很有收获，谢谢啦，以后还请多多指教衷心谢谢。发自内心的感谢！谢谢，很有帮助，我现在是不知所措啊
