1、实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640 培养液。2、10%FBS DMEF/12 培养液。3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于 2L 去离子水中，高压后 4保存。5、胰酶6、冻存液：10%DMSO、10%FBS，其余成分为 16407、真核抗生素： G418: 50mg/ml MDA-MB-231 800ug/ml MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml T47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin）:10mg/mL、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml MDA-MB-
2、231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mLT47D 200ug/ml MDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素） （使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度 5mg/ml，使用浓度 5ug/ml）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度 50Mm,使用浓度 0.01mM）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在 37下使其液化。
3、（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到 15ml 离心管内。（3）将离心管以 1000rpm 转速离心 5min。（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液 6ml，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入 37、5%CO2 细胞培养箱内培养。药筛浓度药筛浓度药筛浓度2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml 离心管、滴管实验流程：（1） 将覆盖率达 80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加 PBS 冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。（2） 加入适量胰酶（一般 25cm2 培养瓶加 0.5ml，10cmdish 加 1ml）
4、，并且晃动几下使胰酶在平底分布均匀，放入 37培养箱孵育。（3） 适当时间后（231、SK-BR3 用 1min，MCF-7、T47D 用 2min，依据细胞不同时间不同）将培养瓶从培养箱拿出来，显微镜下观察细胞形态变圆、粘附性变弱后加入培养液终止酶反应。（4） 用培养液冲洗瓶底，然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。（5） 将悬液 1000r 离心 5min 后重悬，安装实际需要将悬液平分到培养瓶内，一般按 1:3 传代较好。3、细胞冻存准备：培养液、胰酶、15ml 离心管、滴管、冻存管、冻存盒试验流程：（1） 将已经长满的细胞取出，弃去培养液后加入适量胰酶，放入 37孵育适当时间后，观察细胞变
5、化。（2） 用培养液终止反应后，吹匀，将悬液转移到 15ml 离心管内。（3） 以 1000r 的速度离心 5min（4） 弃去上清，加入 1-1.5ml 冻存液，重悬，加入冻存管内（冻存管注意做好标记）。（5） 将冻存管放入冻存盒内。盖好，放入-80冰箱冻存。4、细胞计数准备：胰酶、培养液、滴管、15ml 离心管、计数板、移液器实验流程：（1） 取对数生长期细胞，用适量胰酶消化后，1000r 离心 5min，重悬。（2） 用微量移液器取 10L 悬液，沿计数板一侧缓慢加入，确保悬液均匀充满计数池。（3） 显微镜下计数四角大方格内的细胞数目，求平均值。（4） 根据公式 n=四角大方格内细胞数/4 *10 4 （个） /ml
