1、RNA replication,Reverse transcription=replication,逆转录酶 （reverse transcription),1964年，Temin发现Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制剂遏制。表明：RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中要合成DNA。 Temin又发现放线菌素D能抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般RNA病毒的复制。表明：转录对于RNA病毒增殖是必需的。,Temin提出前病毒假说：原病毒DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。1970年，Temin 在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。
2、,多功能酶：,1、RNA指导的DNA聚合酶活性 2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA杂交体上的RNA 3、DNA指导的DNA聚合酶活性：合成互补DNA。 4、没有35外切酶活性。,特点：,含有Zn2+（是否有锌指结构、DNA结合功能？） DNA合成反应要求有模板和引物。 需适当浓度的二价阳离子（Mg2+、Mn2+） 5 3合成方向,逆转录病毒的基因 组复制过程,第一阶段：合成负股cDNA的大部分 第二阶段：以负股DNA为模板合成一小部分正股DNA链。 第三阶段：完成cDNA的全部复制。,乙肝病毒基因组的复制,其复制需通过逆转录过程经RNA中间体实现 ，其DNA聚合酶也是一种逆
3、转录酶。,逆转录病毒：RNA DNA RNA 乙肝病毒：DNARNA DNA,试管内cDNA的合成,常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mRNA，经逆转录生成的cDNA可代表某一特定基因。 常用的逆转录酶有两种： 来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为AMV-RT； 来自鼠白血病毒称为MMLV-RT。,病毒RNA复制的主要方式,1、病毒含有正链RNA，如灰质炎病毒。RNA（+） 蛋白质（酶） RNA复制 2、病毒含有负链RNA和复制酶如狂犬病毒。RNA（-） RNA（+） 蛋白质、复制病毒RNA（-）。 3、病毒含有双链RNA和复制酶。如呼肠孤病毒。双链RNA RNA（+） 蛋白质
4、RNA（-） 双链RNA 4、逆转录病毒。,讨论题,如何知道DNA复制中先要有RNA引物的合成？ (原料/新合成DNA序列分析/专一核酸酶水解),病毒的复制,病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。 从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。 病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装和释放四个连续步骤。,复制周期,病毒的一步生长曲线,病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为 纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。,一、吸附和
5、穿入,（一）吸附(adsorption) 分两个阶段：静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆。 真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。,裸露病毒的吸附,囊膜病毒的吸附,（二）穿入(penetration) 病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿入方式进入细胞：,1.无囊膜的病毒一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺病毒、小RNA病毒等,病毒胞饮,2. 有囊膜的病毒囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接 进入细胞浆内病毒胞饮: 细胞膜吞入,(1) 膜融合后进入,(2) 病毒胞饮,二、脱壳(uncoating) 不同病毒
6、脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳，释放出基因组核酸。,三、生物合成(biosynthesis),病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。 早期，根据病毒基因组转录成mRNA、指令合成转录合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白； 生物合成阶段，病毒处于隐蔽期 病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双股DNA病毒、单股DNA病毒、单正股RNA病毒、单负股RNA病毒、逆转录病毒和双股RNA病毒。,病毒DNA,早期mRNA,早期蛋白（酶等）,子代病毒DNA,晚期mRNA,病毒结构蛋白,子代病毒子,双股DNA病毒,复制,宿主细胞转录酶,单链正股RN
7、A病毒,（-）ssRNA,亲代病毒（+）ssRNA,早期蛋白,（+）ssRNA,dsRNA复制中间型,（-）ssRNA,（+）ssRNA,大量子代（+）ssRNA,晚期蛋白,装配子代病毒,单股负股RNA病毒,病毒自身携带依赖RNA的RNA多聚酶。,亲代（-ssRNA）,（+）mRNA,蛋白质,（+）ssRNA,子代（-）sRNA,子代病毒,多聚酶,逆转录病毒,四、组装,病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。 绝大多数DNA病毒均在细胞核内组装; RNA病毒和痘病毒在细胞浆内组装。,绝大多数无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。 绝大多数有囊膜病毒以出芽方
8、式释出时包上细胞核膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。,五、释放,Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by Budding,复制周期,思考题1,某种病毒DNA的碱基组成（摩尔百分比）如下：A=32；G=16；T=40；C=12该病毒DNA的特点如何？,思考题2,简要说明怎样进行构建cDNA文库？,思考题3,组织培养的哺乳动物细胞S期长达5 小时，经放射自显影测定DNA复制的速度是0.5微米/分，已知哺乳动物细胞DNA全长1.2米，计算染色体复制时共有多少复制叉在复制？ 8103（如何分析？）,思考题4,已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨基酸序列，然而某些抗血清却能将它们区别开来，这岂不与“蛋白质的一级结构决定其高级结构”的理论相矛盾吗？你如何解释？,思考题5,将某种纯蛋白1mg进行氨基酸分析，得19.5ug的异亮氨酸（分子量=131.2），那么该蛋白质的最小分子量是多少？,
