1、2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA的复制与修复 Replication and repairing of DNA,第 十 四 章,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制 逆转录 DNA的损伤修复,DNA的生物合成方式,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-disconti
2、nuous replication),（一）复制的基本特点,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,1、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G
3、 T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,
4、含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,2、双向复制,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),200
5、8年5月 药学生物化学第六版讲稿,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,3、复制的半不连续性,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片
6、段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（二）参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,1、复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,聚合反应
7、的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,2、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,E. Coli中的DNA聚合酶,原核生物的DNA聚合酶,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中
8、出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD)
9、,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,真核生物的DNA聚合酶,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,3、DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷
10、酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,4、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链
11、的完整,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分 类,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,5、DNA连接
12、酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,连接酶的功能,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制的起始,需要解决两个问题：,DNA解开成单链，提供模板。,合成引物，提供3-OH末端。,1、原核生物的DNA生物合成,（三）DNA生物合成过程,
13、2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,E.coli复制起始点 oriC,（1） DNA解链,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,（2）引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不
14、断生成。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,OH 3,3,领头链的合成,随从链的合成,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,阶段一,阶段二,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,阶段三,阶段四,复制过程简图,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复 制 过 程 动 画,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,复制的终止,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,随从链上不连续性片段的连接,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,2、真核生物的DNA生物合
15、成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,复制的起始,2008年5月
16、药学生物化学第六版讲稿,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,复制的延长,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物去除后留下空隙。,复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase a
17、ssociated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,滚环复制(rolling circle replication),3、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,滚环复制,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondri
18、al DNA，mtDNA)的复制形式。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制 逆转录 DNA的损伤修复,DNA的生物合成方式,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,逆转录的概念,以RNA为模板，以dNTP为原料，在逆转录酶作用下，合成DNA的过程称为逆转录（ Reverse Transcription ）,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,逆转录酶(reverse transcriptase) RDDP 模板：RNA 原料：dNTP 引物：tRNA 产物：cDNA,1、逆转录的物质基础,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,2、逆转录病毒细胞内的逆转录过程,（cDNA),20
19、08年5月 药学生物化学第六版讲稿,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,3、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,复制 逆转录 DNA的损伤修复,DNA的生物合成
20、方式,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,第二节 DNA的损伤与修复,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（一）突变的意义,1、突变是进化、分化的分子基础 2、突变导致基因型改变 3、突变导致死亡 4、突变是某些疾病的发病基础,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（二）引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,化学因素,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（三）突变的
21、分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement),2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,1、错配,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,2、缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排
22、列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变 。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,缺失引起框移突变,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,3、重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（四）DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复,修复的主要类型,2008年5月 药学生物化学
23、第六版讲稿,（一）光修复,光修复酶(photolyase),UV,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,目 录,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,切 除 修 复 动 画,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（三）重组修复,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。 在E. coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。 这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,2008年5月 药学生物化学第六版讲稿,第三节 突变、单核苷酸多态性与个体差异,一、突变（见前节） 二、单核苷酸多态性与个体差异,
