1、1遵义医学院机能学实验学生设计性实验申请表实验名称 尼莫地平与神经生长因子对大鼠坐骨神经损伤再生的影响 年级 2010 级 班级 4 班 专业 临床专业 申请学生姓名及学号 周晟 1010150414 杨偲 1010150415 张园园 1010150416 实验小组组别 第十组 所在实验室 指导教师 刘爱东 填表日期 2012 年 11 月 18 日 2遵义医学院机能学实验室自制立项背景周围神经损伤是指因某些因素造成神经传导功能障碍、神经轴索中断或神经断裂 ,导致躯干和四肢感觉、 运动、 交感功能障碍的一类临床病症1,它严重影响患者的劳动力和生活质量。周围神经损伤极为常见，交通事故、自然灾害
2、、甚至在其他疾病的临床治疗过程中都可能发生。损伤后的再生修复问题一直是创伤外科和神经科关注的重点之一 ,国内外学者对周围神经损伤的再生与修复做了大量的研究。临床上， 周围神经损伤是一种常见的疾病， 虽然可用显微外科技术治疗， 但术后功能恢复仍不十分理想。回顾过去 , 20 世纪初计算出的人类神经再生速度 12mm /d,至今仍为此2。现阶段如何促进神经再生， 最大程度地减少继发损伤， 恢复神经功能， 已成为研究的重点 。近年来研究发现钙通道阻滞剂和神经生长因子对周围神经再生有重要作用3，本实验就尼莫地平与神经生长因子的疗效做进一步研究。实验动物同系健康雄性 SD 大鼠 18 只，体重 2002
3、50g，由遵义医学院实验动物中心提供。大鼠分组饲养，自由进食、饮水，均达到动物标准，动物房维持 22左右。主要仪器 BL-420F 实验系统、哺乳类动物手术器械一套、手术台、纱布、游标卡尺、直尺(10cm)、尼龙线、注射器（ 1ml、2ml）由遵义医学院机能实验中心提供。电子显微镜，深圳市西派克光学仪器有限公司主要试剂和药品 神经生长因子 舒泰神（北京）药业有限公司尼莫地平 天津市中央药业有限公司苏木精伊红染色剂 上海众华生物有限公司研究方案1、实验分组采用随机数字编号的方法将大鼠随机分为 3 组，每组 6 只。尼莫地平+神经生长因子组尼莫地平组空白对照组。2、动物模型制备参照杨飞、张基仁4等
4、方法稍作变动制备模型。10g/L 戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，在大鼠右侧臀肌间隙显露坐骨神经，自梨状肌孔下缘 0.5cm 处整齐切断神经干。用 100 号尼龙线行离断神经端神经外膜缝合，术后局部予以生理盐水冲洗，逐层缝合切口，待动物清醒后分笼。18 只大鼠均做以上处理，且均在右侧做坐骨神经切断，左侧为自身对照。 3、给药方式根据人与实验动物体表面积等效剂量换算方法尼莫地平+神经生长因子组：术后除常规分笼饲养外，每只大鼠给予隔日术侧3肌肉注射 0.5ml(500gkg)尼莫地平5 ，并在术侧腓肠肌肉注射神经生长因子 0.6g/d6。尼莫地平组：每只大鼠隔日术侧肌肉注射尼莫地平 0.
5、5ml(500gkg)。空白对照组：每只大鼠隔日术侧肌肉注射等量生理盐水。术后常规饲养 8 周后取材。此后每天按此方法和剂量分别给药至实验结束。观察指标1.坐骨神经功能指数(SFI)术后观察记录各组大鼠生存状态、 切口愈合情况、有无感染，以及定期观察记录大鼠行走步态，有无甩足现象，实验侧展爪情况，足底溃疡和关节活动情况。设计一长方形过道，底部铺白纸，大鼠两后足均匀沾染黑色墨水后在其上行走，纸上留有足印，取左右侧足各测 3 个参数：足印长度(PL)，即足印的最长距离；足印宽度(TS)，即第 l 趾到第 5 趾的连线距离；中间足趾距离 (IT)，即第 2 趾到第 4 趾的连线距离。将上述 3 个参
6、数代入 Bain 公式(E 试验侧，N 正常侧)计算 SFI ：SFI=109.5(ETS 一 NTS)NTS 一 38.3(EPLNPL)NPL+13.3(EIT NIT)NIT 一 8.8。公式计算结果 0 为正常，一 100 为神经完全损伤7。2.神经电生理测量术后 8 周，采用 BL-420F 生物机能实验系统， 对各组大鼠进行神经传导速度测量。刺激电极钩形针置于离断神经近心端，记录电极插入远心端腓总神经入肌约 15mm 处，刺激强度为 120 毫安，一般以波形达最大振幅，且不引起周围无关肌肉收缩为宜，刺激时间 0.10.2ms,刺激频率 1Hz.。分别记录左右坐骨神经传导速度(MCV
7、)。3.组织学观察术后 8 周电生理测定后， 观察伤侧吻合口愈合及瘢痕形成情况，并且于吻合口远端切取各组双侧坐骨神经 1.0 cm，分别进行苏木精 -伊红染色，电镜观察粗细不均的再生神经纤维，呈束状分布。预期结果1.坐骨神经功能指数测定术后各组大鼠厌动，术侧腿部行动困难，全部出现典型行走跛行，展爪反射消失，均未见感染发生。尼莫地平+神经生长因子组高频甩足及“自噬”现象、足部溃疡的出现与愈合以及展爪反射出现的时间均早于其他各组。尼莫地平组相继出现，空白对照组最晚。各组大鼠有个别死亡，均未见感染，死亡原因不详。各组大鼠均大约在 2 周时候伤口愈合良好。SFI 值于损伤时显著下降，术后 2 周 2
8、个给药组与对照组间 SFI 值差异无显著性(P005)；术后 48 周两组动物 SFI 的绝对值逐渐降低，显示坐骨神经功能得到恢复，其中给药组的 SFI 水平在各时间均为：尼莫地平+神经生长因子组尼4莫地平组空白对照组。2.神经电生理测定手术后 2，4，8 周行电生理指标测定，2 个给药组大鼠术侧坐骨神经神经传导速度较对照组有明显升高。正常自身对照侧神经传导速度 3 组间比较差异无显著性意义(P 0.05)。神经传导速度恢复率经析因分析得到：尼莫地平对神经传导速度的恢复有促进作用(P 0.01)；尼莫地平与神经生长因子联合应用对神经传导速度的恢复具有协同作用(P 0.01)。3.组织学观察术后
9、 8 周所有组别大鼠坐骨神经吻合口均愈合良好，与周围组织有粘连，尼莫地平+神经生长因子组有髓神经纤维多，髓鞘完整，板层排列紧密，轴突膜与髓鞘膜紧密相邻，髓鞘形成好，粘连轻；优于尼莫地平组，空白对照组再生有髓神经纤维最少，排列较稀疏且紊乱，其周围的髓鞘普遍肿胀、变性。吻合口再生神经直径尼莫地平+神经生长因子组最粗，尼莫地平组次之，空白对照组最细。讨论实验采用大鼠坐骨神经损伤模型，造模方法属创伤所致，相当于 Sunderland 第5 度损伤，它的修复过程基本上可以代表典型的周围神经损伤的修复过程。大鼠坐骨神经是建立周围神经损伤与修复的最常用动物实验模型，为诸多学者所接受5。尼莫地平属于 L 型钙
10、离子通道阻滞剂，在临床上主要用于心脑血管疾病的治疗，在本实验中应用属于临床用药新用法研究。在实验中发现，尼莫地平对损伤的坐骨神经功能和形态结构的恢复均具有明显的促进作用，其机制尚难在本实验中阐明，其可能机制为：尼莫地平抑制钙内流，减轻神经元内钙超载，从而保护神经元。抑制神经吻合口处瘢痕形成，增加吻合口通过再生神经的有效面积，从而增加了再生神经的通过数量。相关文献报道为此机制提供了有力的证据： 20 世纪 90 年代，Doong 等8 研究发现 Ca2+拮抗剂能使瘢痕疙瘩成纤维细胞形态变圆，胶原酶合成增加。薛金伟等9提出周围神经损伤的修复不仅仅是神经纤维的再生，同时包括瘢痕修复，并首次应用 Ca
11、2+拮抗剂针对神经瘢痕进行研究，取得良好效果。神经生长因子( Nerve growth factor, NGF)是最早发现的细胞生长调节因子，由成年小鼠颌下腺提纯获得，其主要功效为促神经分化、营养神经、保护损伤神经和促神经再生的作用，临床用于神经挫伤、神经断裂、神经再植等骨科周周神经损伤的治疗10 ，但由于 NGF 半衰期短，水溶液中活性容易受其他因素影响，且其不能透过血脑屏障和血神经屏障，因此临床应用主要限于神经损伤局部部位应用，效应难以长期维持，因此如何进一步发挥 NGF 在周围神经损伤治疗中的作用。还需要进一步的研究11。金毅等12在切断面神经的硅小室内注入神经生长因子，发现再生神经干粗
12、大，轴突数量明显增加。Santos 等13在切断坐骨神经后局给予神经生长因子，发现再生神经纤维的直径、轴突数目及髓鞘厚度均明显优于生理盐水对照组。高春正14证实在移植的硅胶管中加入神经生长因子修复周围神经缺损，新生的有髓神经纤维所占的百分比明显高于对照组。王占友等15 在兔坐骨神经挫伤后于局部施用神经生长因子，术后 4 周神经生长因子组有髓神经纤维基木恢复正常，而生理盐水组直至 6 周才恢复正常。在本实验中给药方式为肌肉注射，方法简便易行，便于临床应用。尼莫地平5和神经生长因子采用靶肌肉注射， 除肌肉吸收入血外还可以直接作用于运动终板，其给药方法已被众多实验所应用。神经生长因子减轻运动终板变性
13、，促进终板再生。周围神经损伤后， 再生运动神经的功能恢复主要靠运动终板的再生与重建，终板的功能与状态能反映出肌肉的功能状态16。本实验预期结果提示：尼莫地平对损伤的坐骨神经功能和形态结构的恢复均具有明显的促进作用，神经生长因子能促神经分化、营养神经、保护损伤神经和促神经再生的作用。应用钙拮抗剂尼莫地平联合神经生长因子治疗大鼠坐骨神经损伤，能取得更好的效果。建议临床上考虑联合用药治疗周围神经损伤。数据的收集及处理方法大鼠的坐骨神经功能指数测定用直尺（10cm）测定收集数据,神经电生理测定用 BL-420F 生物机能实验系统来显示数据。表 1 大鼠的坐骨神经功能指数测定组别 术后 2 周 术后 4
14、 周 术后 8 周尼莫地平+神经生长因子组尼莫地平组空白对照组表 2 大鼠各组神经传导速度结果比较术后 2 周（m/s） 术后 4 周(m/s) 术后 8 周(m/s)组别左侧 右侧 左侧 右侧 左侧 右侧尼莫地平+神经生长因子组尼莫地平组空白对照组统计学分析： 所测数据以 Xs 表示， 应用 SPSS 进行方差分析，组间比较采用多样本均数的 t 检验以 P 0.05 差异具有显著性意义， P 0.01 为差异有非常6显著性意义。参考文献1葛宝丰，剡海字。张功林现代创伤治疗学 FM北京：人民军医出敝社，2001；325-3582 顾玉东. 提高周围神经损伤的诊治水平 J . 中华创伤骨科杂志
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