世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版.doc

1、世界上最完善最详细的神经元原代培养完全黄金版 精华序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过 why.为了让大家少走弯路，根据我杀过 3000 只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，请求多投几票得几个叮当。相信你 follow 我的这篇文章一定会做的很好。我的标题说的很像吹牛，但是我是 严肃认真的说的， I earn it.note:这篇文章全是我个人的经验，99。 9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法，除了最后那一副图是来自下面第 2 行那篇文献，所以我才 说是 99.9%原创。（注：附录的图是常用的消化酶对实验的存活率影响，来自

2、下面链接里的文献）另外，成年鼠的原代培养我没有摸索过，推荐一篇文献在我以前的帖子（无需叮当）（http:/ 本篇专门讨论胎鼠和新生鼠神经元的原代培养。1.材料选择。一定要严格按照国 际上， NCBI 数据库，其他文献的材料一致。胎鼠就要胎鼠，新生鼠就要新生鼠，不能混淆。因为新生鼠有一些受体，在培养的工作中失去功能，会不能再生，比如 NMDA 受体。和文献不同会导致错误结论，甚至困惑。很多人写信问我新生鼠的培养问题，我回答用新生鼠的实验很少，八成是你自己搞 错了实验对象， 请 确认国际上的相关研究文献所用老鼠，再来问我下面的问题。2，培养基选择（neurbasal/neurobasal-a,in

3、vitrogen Co.ltd)。我 强烈不建议用血清培养。原因是：首先，血清刺激胶质细胞和杂细 胞分裂，最后非常影响神 经元 产量；其次，为了抑制胶质生长，往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验；再次，最重要的，血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。Invitrogen/GIBCO 无血清培养基 neurobasal(neurbasal-A)被认为 是最标准，最好的培养基。需要的添加剂为 B27 和谷氨酰胺。培养出的 细胞状态均一，胶 质细 胞几乎不分裂。其中， neuroba

4、sal 是胎鼠培养基，而-A 为新生鼠培养基。不过根据笔者实验，没什么太大区别，都能很轻松培养成功，但是，切忌中途换培养基，要从一而终。很多实验室是不加抗生素的，也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练，不注意，很多人会污染，所以我还是建议加双抗。注意！由于无血清培养基添加剂不是血清，而是人工合成的 B27（也有用 N2 的，但是推荐 B27，只差 10 美金），血清有复杂的解毒作用而 B27 没有，双抗对细胞的干扰，无血清培养基要大的多。所以，如果你在 neurobasal 里添加抗生素，记得用量只要标准量的一半。另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定，所以每次用 时候要现配现加。大概是 0.5-

5、2mmol/l 大部分人用 0.5mmol/l.虽然笔者试过，没加这个也正常生长，但是几乎所有文献都添加，we just simply follow.3.解剖过程一定要全程在冰上预冷。这就意味着，从你 处死母鼠后，胎鼠的大脑的温度要最快的降低到 0 度。另外，在解剖过程中，胎鼠直到皮层或海马被剪碎的过程，有时候可能需要 2 小时，如果样品多。一定要注意多准备 冰袋子。确保你的任何 过程都在冰浴的培养液中 进行（消化步骤除外）。这样可以大大提高存活率。在解剖大 脑时候，有人用 hanks，在其中解剖。根据我的经验，即使是 0 度，神经元还是在进行着很大程度代 谢。所以，hanks 的无糖环境很不

6、利。我个人建议，用 DMEM-高糖或 DMEM-F12+马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，血清可以抑制神经凋亡。这其中还有一个 问题，就是 DMEM 培养液会在空气中 变碱性。国外有的 实验室用 L-15 培养液来浸泡解剖过程中的脑，因 为 L-15 不会再空气中变碱性。没有 L-15 的(国内几乎没有），可以全程用 DMEM-HG 或者 DMEM-F12+血清浸泡解剖过程中的脑。注意注意：一切操作都在冰浴的液体中，所以要多准备冰袋。 （中途冰袋没了的是猪 头）4.关于培养皿的问题。一般来说 ，6 孔板是最佳选择。神经元让人苦恼的问题是，神经元发育的情况和密度相关。大于 6 孔板

7、（比如 6CM DISH）会使得中间很难和周围的细胞密度一样，造成板中间和边缘成熟度不一样，而这会 给实验带来很大干扰。而太小的话（96 孔或 128 孔）细胞会倾向于向中间集中也会照成发育不均匀。所以笔者 经验是 6 孔板是最佳选择。神 经原代培养一定是要包被，用 POLY-LYS 或者胶原。关于 POLY-LYS 包被，我们是包被 30 分钟，吸干晾过夜，然后洗两次，或者只洗一次但是要 30分钟接着晾干。由于 neurobasal 培养法相当成熟，所以没必要用难固定的胶原。5.处死母鼠并把胎鼠解剖时候，一定要注意母鼠状 态，是否有死胎，胎儿胎盘是不是正常，有多少胎，母鼠是多少天的（一般是

8、E16-E18）这些信息也要严格记录。 处死孕鼠后，要立即取出子宫放入冰冷培养液中。注意孕鼠处死后要短 暂的浸泡酒精消毒，防止污染。一般来说，冰袋笔者选择一面蓝 一面白的。 蓝的朝上，可以很清晰看到海马结构。而去除血管膜的时候，白的那面朝上，这样可以很清楚看到血管膜。从处死老鼠到大脑被剥离出这段是人就会做，我就不多 说了。不过有一点要注意，不管你是用皮层还是海马，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出放到冰预冷的培养液中。我建议胎鼠取出来的时候胎鼠就放在冰冷的 缓冲液中。就是说，处死后要迅速把大脑的温度降到 0.6：最影响原代培养的成败因素之一：这小段请大家一定注意看。无论皮层

9、还是海马，上面都是有一层血管膜。注意：一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。可以用解剖显微镜。胎鼠很好剥离，而新生鼠则比较难。这里千万不能粗心大意！ 血管膜没剥离干净的后果是：1 吹打时候很难吹打下来神经元，被迫多次吹打，造成神经元大量死亡；2 血管膜一部分细胞会混入原代培养中，这些细胞往往会分裂，导致你的培养成果根本不能用。可以 说，剥离的不好不干净，实验就是失败的，不可能得到高质量的神经元。注意的事情二：如果是要的是皮层的神经元原代培养，而皮 层的细胞很多，切忌不要放太多皮 层消化吹打！过多的细胞反而会导致神经元大量死亡。另外，请仔细注意文献中要的是皮层哪一部位。没有详细要求的话一般是取

10、顶端。从大脑到单个海马的剥离我不细说了。我现在以海马神经元为例。在所有海 马都成功剥离后，请仔细的去除血管膜，原因上面说过 。最后，请再仔细检查一下是不是都去掉了。确认后，海 马片段被移入一个小烧杯里，加少量培养液，用剪刀剪成 0.5-1 立方毫米的小块，放置冰上准 备消化，7：实验成败的关键之二：消化。一般来 说，我看很多人都用 0.125%的胰酶消化。实话说，胰 酶消化非常的难以掌握速度，而且消化效果真的是- 很烂！稍微不注意，就会消化过头， 细胞都消化光了。而胰酶消化的快，还会出现细胞快速破裂释放出 DNA，和其他蛋白缠结成絮状包裹在组织块外面，使得块里面的不到应有的消化。所以我个人不推

11、荐胰 酶 。想做一个完美成功的消化，我强 烈推荐木瓜酶+DNA 酶。木瓜酶是消化过后，存活率最高的酶（见附图）。笔者是配成 2mg/ml 的木瓜酶。另外要用的是 DNA 酶。DNA 酶的作用是，消化掉破裂细胞的 DNA，避免了释放的 DNA 和蛋白缠结在组织块表面而阻碍进一步消化。DNA 酶由于各个公司的活性不一样，很难有标准 浓度，需要摸条件，不过不是很严格，只要能防止 DNA 缠结就好。木瓜酶的特点是不会消化过头，非常温和。缺点是一定要现配（请直接用无血清的培养液配来保证神经元的营养代谢，而且一定要 现用现配。消化的技巧：消化时候，很多人有不良 习惯，喜 欢用个 50ml 试管装着所有东西

12、。 结果是组织都沉底，下面消化不足，上面消化的没细胞。笔者的技巧是， 用一个 6 或 10CM 培养皿来消化。这样消化液在培养皿里形成浅而广阔的一层，均匀分布着 组织块，从而 彻底解决了上述问题。消化酶是 2mg/ml 木瓜蛋白酶+适量 DNA 酶。木瓜蛋白 酶很便宜请放心。消化过程是 20-30 分钟。由于木瓜蛋白酶温和，因此不会消化 过头，使得你的 实验消化的很 稳定。消化时候请在 37 度温箱里，每 5 分钟稍微摇动一下。注意：1）木瓜酶不要用巯基化合物激活，激活后消化好很多但是成活率坏很多；2）尽量用不含血清的培养液来配置木瓜酶而不是用 hanks，使得神 经元保持营养；3）木瓜酶一定

13、要现用现配。再次重申：除了消化过程中要 37 度，其余任何 时刻都是要浸泡在 0 度（冰浴）的液体中。消化 过后可以用 1ml 血清终止反应（我是用马血清，便宜，但是切忌不要用国产血清，污染几率很大）。把消化用的培养皿放在冰上冷却，然后垫高一面使得液体集中在另外一面便于吹打。整个体系静止 2-3 分钟，然后仔细的去掉上 层的液体，保留消化过的组织块8.实验成败最关键最关键的：吹打。笔者经验是，没有必要用巴斯德管。对于胎鼠和 10 天之内的新生鼠，一般的 1ml 蓝枪头就可以达到满意的效果。在一 边被垫高的皿里面，加入 1-1.5ml 新鲜培养基和少量 DNA 酶，吹打 10 次。吹打 时候要注

14、意，切忌 过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要 缓慢。 轻柔吹打是细胞成活关 键！要用进口枪头，国产的有时候会过细。我们采用的是最合理的分步吹打法。每个 10 次吹打过后，静止 2 分钟。这时候游离的单细胞在上面，而团块会沉到下面去。上面的那层就是你要的单个悬浮细 胞，把它们挪到指定容器里（一样要冷在冰上）。下面沉淀下去的细 胞团块不要丢弃，再加 1-1.5ml 新鲜培养液，重复刚才的步骤，轻柔吹打，再静止 2 分钟，转移上层的单细胞到刚才指定容器里，一共这样分步吹打 3 次。3 次之后如果还有团块在下面，请果断丢 弃。造成 这个的原因就是刚才的血管膜没剥好。这个分

15、步吹打的过程保证了每一个单细胞都避免了过度吹打，而分布吹打又保证了尽可能多的收获单细胞。重申一下，为了保证最大程度收获活 细胞，每次吹打之前，可以加入少量 DNA 酶。这招可以更容易收获大量高质量细胞，尤其是实验 材料不足时候。消化和吹打非常忌讳操作的细胞过多，这样反而会使大量细胞死亡。实验者如果是用的皮 层这种原材料充足的话，切忌不要放入 过多皮层。9（可选可不选，但是我建议全选 ）神经元进一步纯化。 一般来说，收获的细胞悬液已经是很纯的神经细胞了。但是，由于实验者等个人或者客观原因，血管膜可能不会被完全剥离；杂细胞可能也被吹入了细胞悬液；操作者手法不熟练，造成死 细胞过多，影响种板等等原因

16、，还是会影响到培养的神经元的质量。为了克服这些，笔者查了一些文献，经过反复测试采用了 nycoprep 低转速密度-梯度离心。现在这个梯度溶液已 经被公司升级为 optiprep.稀 释时候， NycoPrep 1.077 推荐稀释成 60%，就用 刚 才悬浮细胞的培养液来配置。注意：1.077 被广泛应用于血液中分离血细胞，如果你拿到的 nycoprep(optiprep)不是 1.077，那么 请换算一下稀释度）值得注意的是，皮层和海马可能需要的稀释度稍微有不同。一般来 说，一个 10ml 梯度离心管中，2-4ml 稀释过的梯度液体就够用，取决于你收获的细胞量多少。把你收 获的细胞悬液小心

17、的加到稀释好的梯度剂的上面一层， 经过 1500 转（不是 15000 请注意）5-8 分钟，神 经元被高度压缩到梯度面和上面的培养液分界面那一层。而最下面的梯度剂下的沉淀 则是细胞团块，血 细胞，杂细胞，以及部分小胶质细胞。而最上层最浮头，则是细胞碎片。这样，你就得到了最大限度去除了杂细胞，和细胞碎片，并去掉了一定的胶质细胞的最干净最纯粹的神经元。如果 实验者技术精湛，也可以不用这步，但是用这步会效果更好。注意：母液稀释到 60%只是参考，具体实验室不同可能略微有差别，要摸条件而不是死记硬背。另外皮层和海马浓度也稍微有差 别。有些文献曾 经报 道，在梯度一定的情况下，一些特定梯度可以分开神经

18、元和少突和其他胶质细胞，但是笔者从来没成功过。10.种板。这一步没有那么非常重要，但是如果没 认真弄，浓度的不均一也会使得整个实验失败。记住的是，神经元原代培养是细节 决定成败，任何一个 环节没 处理好，整个实验都会失败。种板密度过低是非常有害的。首先，神经元互相接触的几率小，难以存活和成熟。其次，胶质细胞会大量分裂，导致神经元变得更少，从而得到失败的实验。密度过高也是很有害的。由于营 养争抢，密度 过高有可能导致局部 细胞营养枯竭死亡。另外，高密度会导致细胞聚团，结果也是 细胞不正常形态或者死亡， 导 致错误或失败的实验结果。笔者的经验是 6 孔板每一个孔要有 7100000 个正好（如果是

19、台酚蓝染色只记录活细胞，那么酌情减少密度）。注意，注意！由于神经元的成熟速度和接种密度有很大关系，所以细胞计数一定要非常严肃认真！一定要所有格子都看！如果发现计数板细胞不均匀，宁愿重新计数！由于接触抑制现象，适当密度的神 经元可以抑制胶质细胞生长，从而达到理想的 实验由于 neurbasal 培养液相当昂贵，所以种板时候是不用它的，而第一次换液才用。一般种板 时候我们用的是 DMEM-HG 或者 DMEM-F12 +10%马血清。注意一定要进口的。国产杂质很多会导致莫名其妙的细胞死亡。马血清会抑制神 经元凋亡并且抑制胶质细胞生长（FBS 也可以，但是太 贵）种板注意事项一：种板时候的溶液推荐使

20、用含有谷氨酸的培养液。神经元的 NMDA 等谷氨酸毒受体一般 3 天后才会出现。所以种板 时候有谷氨酸不会导致细胞毒性反应。而 这时候的谷氨酸反而是有利条件，可以促使神经元 贴壁，从而提高存活率。注意事项二（严格注意）种板后都是要摇晃板摇匀细胞，切记！千万不能圈圈摇晃！圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生 长 不均匀，会直接导致实验失败。正确的摇法是左右平行翻转角度，然后前后平行翻 转角度，千万不要让里面液体画圈！注意事项三（严格注意）种板后过过一定时间要换成正常标准培养神经元的 neurobasal+b27+谷氨酰胺的无血清培养液。很多 paper 是 1 小时就换液

21、，理由是胶质细胞贴壁差，会除去。但是笔者的经验来看，这是极端错误的！1 小时换液，神 经元还没有完全 贴壁，这时候换液会吹下很多神经元，流到孔另外一侧再贴壁，直接照成一个孔内细胞分布不均匀，从而成熟的不均匀。严格来说这种事情直接实验失败。笔者的经验是种板 4-6 小时换液，但是千万不能超 过 12 小时。原因是：超过 12 小时，混在细胞悬液中的大量细胞碎片也会牢牢贴壁，而细胞碎片直接影响神经元存活和正常代谢；另外 12 小时后，胶质细胞会开始分裂，这时候就很难抑制了。笔者推荐是 4 小时，但是别超过 8 小时。注意事项四：4 小时后换液时，请轻轻摇晃板几下再换。原因：细胞碎片贴壁很慢而且不牢

22、固，这时候的摇晃可以最大程度去掉细胞碎片。然后，注意：细胞请再用没有加血清的，种板时候用的培养液清洗一次，也是要轻微摇晃，来进一步去除细胞碎片，从而得到良好的细胞生长环境。有条件也可以洗两次，但是笔者觉得一次足 够。洗了之后吸干液体，换成 neurbasal+B27+谷氨酰胺的神经元专用无血清培养基。对于原代培养，是细节决定成败 ，一个地方不 够好会满盘皆输 ，所以请严肃对待。（德国队的 fans 于凌晨）ugly 分界线下面是对版面一些犯错误的研究方法中最严重的错误之一的提醒，请大家注意，我把回帖 编辑到这里了。enjoy.刚回答了一系列形形色色的问题，我把这个问题挑明了说。如果您不相信 n

23、eurobasal 最好的而还是坚持用 DMEM 之类的培养液，麻烦检查一下你们的DMEM 或者 MEM 或者 DMEM-F12 的 invitrogen 产品序列号，到网站上检查下相应的组成公式。很多这种培养液都是含有谷氨酸，而且是 mmol 级的。成熟的神经元 10um 的谷氨酸即可照成细胞凋亡，而谷氨酸受体 4-6 天就开始表达，如果胎鼠神经元经历了 mmol 浓度的培养液中的谷氨酸 还不被毒死，那就是怪事了。新生鼠不受这个限制，新生鼠原代培养没有有功能的 NMDA 受体，ugly 分界线最雷到我的，是板上有人用材料非常混乱，一会用胎鼠，一会用新生鼠，一会成年鼠的你们这叫对自己不负责任！

24、 we do all cases seriously！ 而不是凭借肉眼观察和猜测。做原代培养的，首先就是收集大量背景文献，看看你的相关要求的国际公认的做法是用哪种。胎鼠和新生鼠虽然形状一样，但是神 经元的功能一点都不一样，表达受体都不一 样。 大部分实验都是用胎鼠，而新生鼠往往用来培养测一些 LTD 之类的（not quite sure,文献太少），所以有人 问我新生鼠的问题，我都是说你先看下背景文献是不是你搞 错了。而成年鼠是另外的培养方法，要求更小心仔细和特别的处理。硬套胎鼠的原代培养必然导致失败。另外，在一些药物保护实验中，不要以为 NGF 就一定对神经有很大作用，笔者的 经验是，想要细

25、胞存活，FGF2 是最佳选择但是，FGF2 会导致细胞变化很大，所以还是别用在原代培养中，不过成年鼠培养一定要用FGF2。对于一些雷到我的，我只能再次 说， 请收集足够的背景文章在去 选择合适材料，please do it carefully and seriously!祝大家都能培养出健康漂亮的神经元，欢迎大家来问问题（如果是美女的话， 给个电话我会很开心）声明，除了最后一幅图是来自别 的文献，前面所有的 经验都是我的原 创，从无数失败总结出的我认为最完美的神经原代培养。最后提醒大家注意：nycoprep(optiprep)可能有很多浓度，但是 NycoPrep 1.077 以前是最常用的，笔者默认的就是用这个溶液配置的密度梯度。如果您买到的不是这个密度， 请换算一下。笔者当时只有 NycoPrep 1.077 在中国能 买到，现在可能会有更多浓度供选择，请大家注意换算。