1、第十二章 病毒的分子生物学,12.1 病毒分子生物学研究的内容,病毒分子生物学是用现代分子生物学的新理论、新技术和新方法对病毒基因组的结构与功能，基因组的复制、表达和调控，病毒与宿主的相互作用关系等进行研究的一门学科。,人类对病毒的研究成果在现代分子生物学的发展史上，做出了重大的贡献。许多分子生物学上的重大突破都是以病毒作为模式或研究材料而进行的。,其研究成果除了揭示许多重要的分子生物学过程之外，对人类认识病毒感染、致病的分子本质，为病毒引起疾病的诊断、预防和治疗提供了理论基础，促进了基因工程疫苗和抗病毒药物的研制和发展。,病毒分子生物学研究领域,12.1.1 病毒基因组的结构 12.1.2
2、病毒基因组的复制和表达调控 12.1.3 病毒对宿主细胞的影响 12.1.4 病毒与肿瘤发生 12.1.5 病毒的基因工程疫苗与病毒载体,12.1.1 病毒基因组的结构,不同类型的病毒，其基因组有很大差异。在核酸类型上，有DNA病毒(如腺病毒)，有RNA病毒(如反转录病毒)，但对每一种病毒来说，它只能含有一种核酸。,从核酸结构上看，有的是单链核酸，有的是双链核酸，有的是线状，有的是环状。 一些单链RNA病毒的基因组还具有不同的极性，有的是正链RNA，有的是负链RNA。,有的正链RNA病毒基因组5端有帽子结构，也有的正链RNA病毒基因组3端有poly(A)尾结构。,相对于能独立生活的微生物来说，
3、病毒的基因组非常简单。病毒核酸的相对分子质量约为1.61071.6108，仅为一般细菌基因组的1l/10。,12.1.2 病毒基因组的复制和表达调控,病毒进入活的易感宿主细胞后，借助于宿主细胞本身提供的原料、能量、酶等，以自我复制的方式进行繁殖。,病毒基因的表达包括转录和翻译两个过程。 正链RNA病毒的基因组除了作为模板复制出子代RNA之外，还有mRNA的作用。作为翻译的模板，一般先翻译出单一的大分子肽链，然后再由蛋白酶降解为不同功能的结构蛋白等。,负链RNA病毒的基因组无mRNA的功能，必须由复制出的互补RNA(cRNA)来发挥mRNA的作用。,12.1.3 病毒对宿主细胞的影响,病毒只能在
4、活细胞中存活，因此，病毒与宿主细胞之间有着十分密切的关系。病毒利用宿主细胞的细胞器、能量和酶等进行自身的复制，并通过宿主细胞的蛋白表达系统来表达自身所需的蛋白质，这些过程都将会对宿主细胞的形态和功能产生重大的影响。,病毒对宿主细胞的影响主要体现在病毒对宿主细胞形态和结构的影响以及病毒对宿主细胞功能的影响两个方面。,12.1.4 病毒与肿瘤发生,人类和动物肿瘤的形成除了与遗传和环境因素相关外，某些DNA和RNA病毒也可以通过不同的机制诱发恶性肿瘤。有些病毒直接作用于细胞的基因组，使细胞增殖，最终导致肿瘤形成；有些病毒则通过抑制机体的免疫系统，诱导细胞恶性转变，形成肿瘤。,有些病毒常伴随一些特定肿
5、瘤的发生，但它们与肿瘤的关系还未得到确认.例如在艾滋病病人中引发的Kaposis肉瘤。 总之，大约15%的恶性肿瘤与病毒有关，因此研究肿瘤的病毒病因具有十分重要的意义。,12.1.5 病毒基因工程疫苗与病毒载体,基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表达病原微生物的一段基因序列，将表达产物(多数是无毒性、无感染能力，但具有较强的免疫原性)用作疫苗，例如正在使用的大多数乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。,常见的基因工程疫苗包括亚基疫苗和肽疫苗两类。以流感疫苗为例，其途径就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出来，再制备cDNA,克隆到大肠杆菌中，高效表达该抗原。,由于基因工程疫苗具有
6、安全性好、产量高、成本低，以及良好的免疫原性，它必将成为传统疫苗的有效替代疫苗。,12.2 DNA病毒的分子生物学,DNA病毒基因组有单链和双链两种结构，并以线状或环状形式存在，大部分为单一分子，也有的由数个片段的DNA分子构成分段的基因组。,动物DNA病毒多为双链DNA基因组，腺病毒、痘病毒、疱疹病毒都是双链线状DNA基因组，末端有重复序列，经退火能形成环形分子。 腺病毒(Aflenovirus)是一种典型的双链DNA病毒，下面以腺病毒的基因表达调控为例，简要介绍DNA病毒的分子生物学。,12.2.1 腺病毒的发现,1953年，Rowe等人从外科手术摘除的儿童腺体中分离到一种致病因子，可以使
7、培养的细胞发生慢性进行性病变，称之为腺体退化因子，后来证明这种致病因子是病毒，1956年，Enders等建议命名为腺病毒。,腺病毒分布十分广泛， 从各种胎生哺乳动物、鸟类和两栖类动物中都已分离到。 腺病毒科分两个属：1、哺乳动物腺病毒属 (Mastadenovirus)2、禽腺病毒属(Ariadenovirus)。,腺病毒感染细胞后可关闭宿主细胞某些基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致使细胞的功能失常。 腺病毒致癌的分子机理是目前分子病毒学的一个重要研究领域。,12.2.2 腺病毒的毒粒结构,完整的腺病毒颗粒其相对分子质量1.7108-1.85108，沉降常数约560S，在 CsCl中的密度为1
8、.321.35g/cm3。腺病毒对热和酸稳定，能在肠道中存活。腺病毒颗粒无包膜，外边是蛋白外壳，中间为紧密的核心颗粒，内含单一拷贝的双链DNA。,12.2.3 腺病毒的基因组结构,腺病毒基因组为线形双链 DNA，人类腺病毒基因组包括早期基因 E1A、 E1B、E2A、E2B、E3 和 E4以及晚期基因 L1、L2、L3、L4 和 L5。,12.2.4 腺病毒的复制,12.2.5 腺病毒的基因转录,12.2.6 腺病毒与肿瘤,至今尚未发现腺病毒感染与任何人类肿瘤的关系。但许多的人类腺病毒却可以使啮齿动物的培养细胞发生转化或使这些动物产生肿瘤。,12.2.7 腺病毒作为基因治疗的载体,腺病毒用作基
9、因治疗载体和疫苗研制有着广阔的前景。腺病毒基因组的E1区和E3区可以作为外源基因的插入区。E1区缺失的腺病毒可克隆约4.7 kb的外源DNA，而E3区缺失的腺病毒可以克隆约8 kb的外源DNA，一些特定的腺病毒株已被用于人类疫苗的研制。,腺病毒作为基因治疗载体有着以下几方面的优点： (1)腺病毒基因组研究的比较清楚，便于进行遗传操作。 (2)其感染一般不引起明显的症状，与宿主染色体整合的机率很低，作为基因治疗的载体比较安全。,(3)可以感染不同类型细胞，易于进行体外培养，病毒感染细胞滴度高，可在细胞内有效复制。 (4)腺病毒感染细胞后可以高水平的表达蛋白，在感染后期，宿主基因表达被关闭，易于高
10、水平表达外源基因。,12.3 RNA病毒的分子生物学,RNA病毒基因组均呈线状，有单双链之分，有单一分子，也有的基因组是分段的。RNA的二级结构对病毒基因表达调控有重要影响。,下面介绍一种典型的RNA病毒，黄病毒科丙型肝炎病毒属的成员丙型肝炎病毒(HCV)。,12.3.1 HCV的发现,丙型肝炎病毒HCV(hepatitis C virus) 是应用分子生物学技术对病毒进行研究的成功实例。,12.3.2 HCV基因组的结构与功能,HCV是有外膜的单正链RNA病毒，基因组长约l0000 nt。HCV仅有一个几乎为全基因组长度的翻译可读框ORF，编码30103033个AA的多聚蛋白，经过蛋白酶加工
11、，切割成结构蛋白和调节蛋白。许多黑猩猩和人类HCV毒株已被完全测序。,12.3.3 HCV基因组的复制,12.4 反转录病毒的分子生物学,反转录病毒基因组是线形正链RNA, 正链RNA没有mRNA活性，需要在自身的反转录酶的作用下，将正链RNA反转录成双链DNA，通过向宿主细胞基因组的整合，在宿主细胞RNA聚合酶的作用下转录出mRNA。,人类免疫缺陷病毒(HIV)是最典型也是最重要的反转录病毒。以下简要介绍HIV的分子生物学。,12.4.1 艾滋病与HIV,艾滋病是一种导致以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，人类免疫缺陷病毒(HIV)是其病原体，感染者终生携带病毒，目前缺乏有效的治疗手段
12、。,12.4.2 病毒的结构与生活周期,HIV颗粒呈球形，直径约110 nm, HIV颗粒可分为包膜、衣壳和病毒核心三部分。核心内部是两个长度为9.2kb的单股正链RNA，核心外侧为脂质双层组成的外膜，膜上有穿膜蛋白gp41和外膜蛋白gpl20。,HIV的生活周期包括以下阶段：吸附， 侵入和脱壳，反转录，整合，病毒RNA和蛋白质的合成，装配，释放，成熟。,12.4.3 病毒基因组的结构与功能,人免疫缺陷病毒属于反转录病毒科慢病毒属，分HIV-1型和HIV-2型。,HIV基因组两个相同的正链RNA每条链均包含了HIV结构与功能所需的遗传信息，两条RNA单链被核衣壳蛋白所包裹，并通过其5端非共价结
13、合，形成二聚体。,在HIV基因组RNA的5端具有帽子结构，3端有poly(A)尾巴，在反转录并整合后所形成的前病毒cDNA的两端，为长末端重复序列(LTR)。LTR具有启动子和增强子的双重功能。,HIV基因组长约9.2 kb。能编码至少17种蛋白质，除具有与其他反转录病毒相似的gag、pot和env基因外，还可编码多种调节蛋白，因此HIV又被称为复杂性反转录病毒。这些基因的排列十分紧凑，部分区域有重叠，除少数为断裂基因外，多数基因是连续的。,在HIV基因组中，有三个编码结构蛋白和酶的基因，分别称为gag、pol和env，其中gag与pol使用不同的阅读框架，并有部分重叠。此外，还包括6个编码调
14、节蛋白的基因。,12.4.4 HIV基因转录的调节,在宿主体内，病毒基因的表达及调节是病毒与细胞相互作用的集中体现。与那些简单的反转录病毒相比，HIV具有更完善的表达调控系统。,一方面可以直接利用宿主细胞的调节机制，另一方面又能编码自身的调节蛋白。 宿主细胞转录因子和病毒调节蛋白在病毒RNA的转录、转录后加工、翻译和翻译后修饰等各个环节中都能发挥重要的作用。,而宿主以及与HIV共感染的其他病毒，也能借助于细胞因子和病毒基因产物来调节病毒基因的表达。 由此形成了错综复杂的调节网络，可以精细地调节病毒基因转录和翻译过程的启动、关闭及其速率，按照既定程序完成病毒复制的过程。,与真核细胞基因表达过程相
15、对应的是，HIV基因表达的调节表现为多级调控系统，存在着多个调控点，可大体划分为转录水平的调节、转录后水平的调节、翻译水平调节和翻译后水平的调节，其中转录水平的调节，是HIV调节基因表达的主要环节。,12.4.5 病毒基因转录后的调控,HIV mRNA的加工和转运是在病毒基因产物和细胞调节因子的协同作用下完成的。HIV可以通过它的加帽位点和poly(A)信号完成mRNA的加帽和加尾修饰；并利用其RNA基因组中存在的至少4个剪接供体位点和6个剪接受体位点，产生30余种单剪接或多剪接的产物。,Rev蛋白在HIV mRNA的加工过程中起着重要作用。Rev是促进HIV基因表达由早期向晚期转换的“开关”
16、。 Rev通过与 HIV mRNA中存在的 Rev 效应元件(RRE)结合而行使功能。通过对mRNA剪切和转运过程的调节，Rev使未剪接的gag-pol mRNA被稳定地转运到细胞质并使它们得到翻译。,12.4.6 病毒基因的翻译和翻译后调节,HIV可以通过控制其mRNA的稳定性以及mRNA的翻译效率，在翻译水平上调节基因的表达； HIV的env、gag 和 pol 等基因中有一种顺式作用元件(CRS)可以阻遏env、gag和pol等晚期基因表达。,在HIV基因表达的早期，只合成病毒的调节蛋白，如Tat、Rev等； Rev积累到一定程度后，与RRE充分结合，使CRS对翻译过程的阻遏作用消除，促使HIV基因表达由早期转入晚期，开始结构蛋白的合成和病毒颗粒的装配。,Rev（反式） RRe(顺式) CRS（顺式）,HIV翻译后加工包括： 包膜蛋白N-末端信号肽的切除； 二硫键的形成及氨基酸的共价修饰； 包膜蛋白的糖基化等。这些加工过程都由宿主细胞完成。,
