1、应用微生物学,Applied Microbiology,应用微生物学,概论 微生物的生长 微生物的代谢 微生物的遗传与遗传育种 微生物基因工程 微生物的基因操作系统 微生物酶工程 微生物发酵工程 微生物代谢工程,概 论,基本概念 应用微生物学的发展 微生物细胞的结构 重要的应用微生物,定义,应用微生物学:以一定的直接或间接应用目标研究微生物及其相互作用和与环境的作用的科学。(applied microbiology)利用微生物与微生物学基础知识，通过生物技术手段来实现一定应用目标的学科。 (microbiology in application),微生物的特点,资源量大（多样性丰富） 生物量大
2、（生长迅速） 可塑性大（便于操作） 个体小（便于运输、携带）完成自然界的物质循环 造福人类 引起灾难,当前人类面临的问题,资源的压力 环境的挑战 传染病的新生与复发,微生物的应用部分,细胞 基因 基因产物（酶、蛋白质） 代谢产物,应用微生物学需解决的问题,微生物菌种的获得和优化 微生物培养条件的建立和优化 微生物的应用,应用微生物学研究的一般流程,提出问题（工业、农业、环境、健康、国防）微生物？ NoYes 菌种 解决问题发酵 解决问题 应用 解决问题,应用微生物学的发展 微生物学的发展是与应用紧密联系的,逐步建立方法认识微生物Leenwenhock (1673) 显微镜Jenner (179
3、8) 牛痘Basteur (1860s) 发酵、低温灭菌、自然发生Koch (1881) 纯培养 微生物形成产业Fleming (1929) 青霉素Waksman (1944) 链霉素 现代生物技术Cohen (1972) DNA 重组,微生物细胞的结构,细胞壁形态保持、物质交换、信号识别 细胞膜转运 细胞质酶、反应场所 细胞核遗传物质 核外遗传物质线粒体、质粒,重要的应用微生物,病毒：-噬菌体 细菌：大肠杆菌(E.coli)棒杆菌(Corynebacterium) 放线菌：链霉菌(Streptomyces) 酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia) 真菌：曲霉(As
4、pergillus),第一章 微生物的生长,微生物生长的条件 培养基 生长动力学,微生物细胞的化学组成,细胞中几种主要元素的含量 (干重的百分数),细胞干物质中主要组分和含量(%),微生物生长的条件物质条件,水 aw=Pw/Pw0,微生物生长的条件物质条件,碳源和氮源 O H P S K Ca Mg Fe Mn Cu Zn Mo Co Ni V B Cl Na Si 维生素、氨基酸等,微生物的营养类型,光能无机营养型（光能自养型 Photolithoautotrophy） 光能有机营养型（光能异养型 Photoorganoheterotrophy） 化能无机营养型（化能自养型 Chemolit
5、hoautotrophy） 化能有机营养型（化能异养型 Chemoorganoheterotrophy）,微生物生长的条件环境条件,pH 中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱 温度 最适、生长、耐受 氧气 严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧 压力 渗透压极端环境微生物 (extremophile),极端微生物与不可培养微生物,极端环境微生物 (extremophile):依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物 嗜热菌：50-80C (hyperthermophiles80C) 嗜冷菌：9 嗜盐菌： 3M 嗜压菌不可培养微生物 (VBNC vive but non-cultured),培养基
6、提供微生物生长所需物质与环境条件的体系,培养基的组成要素,碳源、氮源、提供各种元素的无机盐 生长因子或含生长因子的物质 水、固化基（固体培养基） pH、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件,培养基的种类,按物理状态：固体、液体、半固体 按化学组成：合成、丰富、半合成 按使用目的：种子、发酵、筛选、再 生、富集,培养基的选择和设计原则,适用：利于达到目的利于下游工艺重复性好 经济：原料价格原料用量全工艺综合平衡 安全：环境影响生物安全培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容,生长动力学,增值曲线 （Multiplication curve）：细胞数-时间生长曲线 （growth curve）：细
7、胞量-时间,微生物生长的实验计量,显微计数 菌落计数 浊度测定 细胞干重,微生物生长的数学描述,比生长速度(specific growth rate) = dx/xdt细菌 0.6-1.2酵母菌 0.3-0.5放线菌 0.1-0.3真菌 0.1-0.3生物量倍增时间(biomass doubling time)td=ln2/ 增值度(multiplication degree)x/xo,第二章 微生物的代谢,微生物初级代谢 微生物次级代谢 代谢调节,微生物的代谢,微生物细胞所进行的生化反应的总和物质代谢 细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程 能量代谢 载体 信息代谢,微生物初级代谢,微生物从环
8、境摄取物质、获得能量、合成自身新物质的过程营养物 废弃物 能量（用于生长）能量合成代谢 （用于运动和物质转运）细胞组分 酶 分解代谢能量来源,重要的初级代谢途径,糖酵解途径 糖代谢的共同分解途径 三羧酸循环 将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量 磷酸戊糖途径 产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物 ED途径 细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径 氨基酸合成途径,糖酵解途径(Embden-Meyerhof pathway),GLC HXK ZWF SOL GNDG6P G15L P6G RU5P PGIF6PPFKFBPF16P FBAGLYG3P DHAP GAP TPI TDHP13G PG
9、K 3PG GPM2PG ENOPEP PYK PDC ADH PYR ACA ETH,葡萄糖经酶的催化降解成丙酮酸并伴有ATP生成的过程。在动物、植物、微生物细胞中，这一过程是分解葡萄糖产生能量的共同代谢途径。,三羧酸循环(Krebs cycle),PYR ACoAMDH CITMAL OAA CTTFUM ACOFUM ICISDH OSM IDPSUC SUCC AKGLSC KGD丙酮酸进一步氧化脱羧形成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A再经过氧化、脱羧，最终产物为二氧化碳和水，并伴有大量能量产生的一系列反应过程。,磷酸戊糖途径,氧化（产生NADPH ） RU5P P6G G15L G6P RKI
10、 RPE 非氧化 R5P X5P （分子重排 ）TKL TKLGAP S7P E4PTKL F6P,ED途径,存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的, 将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。,氨基酸合成途径,GLC 3PG Ser, Gly, Met （3磷酸甘油酸衍生型） PPP R5P PEP Phe, Try, Trp （芳香族氨基酸） His PRY Ala, Val, Leu （丙酮酸衍生型） OAA Asp ASA Lys（草酰乙酸衍生型） TCA Asn HS Thr AKG Met IleArg Glu Gln （酮戊二酸衍生
11、型） Pro,微生物次级代谢,次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。次级代谢（前体聚合、初级代谢 结构修饰、装配） 营养物 前体 次级代谢物（初级代谢物）,次级代谢的生物学意义,次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。维持初级代谢的平衡 次级代谢产物作为储藏物质的一种形式 使菌体在生存竞争中占优势 与细胞分化有关,青霉素,S CH3 R-CO-NH-HCCH CB A CH3OC-N
12、 - CHCOOH 侧链： R-CO- 母核：噻唑环 A ， -内酰胺环 B,几种青霉素的侧链和抗生素效价比较,青霉素的生物合成,代谢调节,细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。,代谢调节与育种,研究微生物的代谢规律和调控机制，除了有理论意义，更重要的是能有目的地改造微生物使它能最大限度地生产人类所需的代谢产品，并为此提供最适合的环境条件，从而发展生产，造福人类。从某种意义上讲，越是理想的高产菌株，就越偏离它在自然进化中建立起来的调控机制。许多遗传育种工作就
13、是为获得目标代谢产物合成不受或少受代谢调控的“不正常”菌株。,代谢调节的位点,DNARNA 酶底物 底物 产物（营养物） （或中间物） 底物进入，酶的活性，酶的合成,代谢调节的本质：酶的调节,酶合成的调节：诱导与阻遏基因水平酶活性的调节：反馈抑制蛋白质水平,适应现象,例1，大肠杆菌乳糖代谢： 半乳糖苷酶乳糖 -半乳糖 + 葡萄糖E.coli生长于无乳糖培养基， 半乳糖苷酶：3 分子/细胞E.coli生长于含乳糖培养基， 半乳糖苷酶：3000-5000 分子/细胞例2，大肠杆菌色氨酸代谢：E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶，当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。细胞需要某种酶
14、时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。乳糖：诱导物(inducer) 色氨酸：辅抑物(corepressor),底物与诱导物,底物不等于诱导物,乳糖操纵子,i P O Z Y A 调节基因 i ：编码阻遏蛋白 启动子 P ：有CAP(CAP与cAMP复合物)和RNA聚合酶两个位点 操纵基因 O：阻遏蛋白结合位点 结构基因 Lac Z： 半乳糖苷酶Lac Y： 半乳糖苷透性酶Lac A： 半乳糖苷转乙酰酶,协同诱导和顺序诱导,协同诱导I a、b、ca b c 顺序诱导 A B C DI aB bC c,操纵子(operon),
15、I P O S1 S2 S3调节基因 启动基因 操纵基因 结构基因 变构 (+ or -) 外界信号调节蛋白 I or CoR操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。,诱导与阻遏,调节 调节蛋白活性 操纵子 结构基因 酶合成诱导 正 打开 表达 诱导 负 打开 表达 阻遏 正 关闭 不表达 阻遏 负 关闭 不表达 ,反馈抑制,反馈抑制：在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。E1 E2 E3 E4A B C D E 反馈抑制能对环境变化做出快速反应 特点： 1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制2，受抑制的是途径中
16、的第一个酶3，反馈抑制是可逆的,别构酶(allosteric enzyme),有多亚基和四级结构 有结合底物的活性中心和结合调节物的别构中心 活性中心和别构中心在酶分子的不同部位,分支生物合成途径的调节,P1A B CP2 协同反馈抑制 同功酶反馈抑制 累积反馈抑制顺序反馈抑制（细调）,协同反馈抑制,P1A B CP2合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。,同功酶反馈抑制,P1A B CP2合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，
17、只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。,积累反馈抑制,P1A B CP2每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。,顺序反馈抑制,P1A B CP2合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。,第三章 微生物的遗传与菌种选育,微生物的遗传物质 基因突变 基因重组 遗传育种,微生物的遗传物质,核酸(DNA RNA)
18、染色体 染色体外遗传物质,DNA是遗传物质的实验证明,肺炎双球菌转化 S - dead， S - alive， R - alive S dead - S - S R噬菌体感染T2(DNA-32P,protein-35S) - E.coli -上清T2（ 35S ）沉淀E.coli（ 32P ） 双螺旋模型,遗传育种,基本过程基因突变、重组、导入、敲除 筛选出发菌株 包含变异株的群体 优良变异株 目的株检验 检验产生变异株 选择变异株 检验变异株,基因突变,大的突变，如染色体的畸变，染色体的数目与结构发生改变、断裂、大片段缺失、移位等，可影响到很多基因的功能。这类突变对细胞的损伤很大，往往导致细
19、胞的死亡。 小的突变，只涉及DNA分子中一个或少数碱基的改变，又称为点突变。点突变发生较多，存活的突变体也较多，因此有时基因突变就专指点突变。,基因突变的类型,基因型置换：GA, CT 转换( transition)；G,A C,T颠换(transversion)移码(frameshift)：DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失 表型形态：造成形态发生改变的突变致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变条件致死：在一定条件下有致死效应的突变生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等 翻译同义、错义、无义(UAG, UGA, UAA)、终止码、抑制,基因突变的特性,稀有性 突变率低（
20、可通过理化处理提高突变率） 随机性 独立性 Kmr 10-5, Apr 10-6, Kmr Apr 10-11 可逆性 回复突变率也很低 稳定性突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。,几种微生物每次复制的突变率,诱变剂,能引起微生物遗传物质发生改变的化学、物理、生物因子化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯） 物理：短波（紫外线）射线（X-射线、射线） 生物：噬菌体、质粒、转座子,诱变剂的作用,基因突变的应用-诱变育种,虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。诱变育种的基本步骤：出发株诱变剂处理初筛复筛鉴定一般要进行多次，以
21、积累有益突变。诱变谱系：诱变剂处理1 诱变剂处理2 出发株 中间株1 中间株2 目的株,诱变育种的关键环节,出发株：性状、潜力 诱变处理：诱变剂选择、剂量 筛选：方法、筛选量High-throughput screening,致死率与诱变效果,诱变育种的新技术,离子注入 激光 微波 超声 太空,突变株的筛选,初筛：弃去大量无价值菌株 复筛：选出少数有价值菌株方法：直接测定利用可观察现象营养限制培养基选择培养基,组成型育种, 半乳糖苷酶 加诱导酶抑制剂培养基：乳糖+邻硝基-D-岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂） 只有组成型能利用乳糖 交替培养法培养基1：乳糖培养基2：葡萄糖交替培养使组成型优势扩大,交替
22、培养法,营养缺陷型育种,营养缺陷型 C-A B C B 积累A B C D 积累D,抗反馈抑制育种,原理：产物 + 酶（结合于调节中心） 反馈抑制类似物+ 酶（结合于调节中心） 影响生长抗类似物的变异株 类似物与酶的调节中心不能结合 产物与酶的调节中心不能结合 反馈抑制解除 产物能过量积累,抗反馈抑制育种举例,苏氨酸C.crenatum AS 1.542 0 mg/ml MNNGLR-1458 AHVr 6mg/ml 1 MNNGLRA-96 AHVr 8mg/ml ,Met- 3.5 MNNGLRA-359 AHVr 10mg/ml ,Met- 6.5LRA-359-66 7.0 DESD2
23、0-23 AHVr 20mg/ml ,Met- 9.0m85 13.0,Asa Hse Thr IleMetAHV(-氨基-羟基戊酸): Thr, Ile结构类似物,抗底物类似物育种*,海因酶（二氢嘧啶酶）5-氟尿嘧啶：底物(尿嘧啶)类似物，诱变剂抗底物类似物 大量产生分解底物(类似物)的酶培养剂：平板培养剂+ 5-氟尿嘧啶UV NTG NTG+5-FUJ43 J404 BO419 M390.275 0.714 1.34 4.32 IU/ml,产物压力法*,L乳酸ADH丙烯醇 烯醛（对细胞有毒性）NTG 丙烯醇AS3.3461 HBF12（从21株中选出）乳酸 68 96乙醇 16 4ADH
24、50 12,基因重组,基因重组是遗传物质大范围的改变，涉及一个或多个基因、部分染色体甚至整个基因组。有性生殖：与高等生物相同，限于产有性孢子微生物 细胞融合：通过原生质体 结合：通过细胞间接触 转导：通过噬菌体为媒介 转化：游离DNA直接进入宿主细胞 感染：病毒DNA进入细胞,细胞融合育种,溶菌酶A+B- A+B-PEG A+B+ 再生 A+B+溶菌酶 (A-B-) (A-B-)A-B+ A-B+亲代细胞 原生质体 融合原生质体 融合子,原生质体的制备,细胞培养：对数初期 去除细胞壁：缓冲液渗透压和酶反应条件利用诱变育种可提高突变率,原生质体融合,化学融合：PEG 电融合 激光诱导融合,融合子
25、的筛选,选择性培养基 双亲本的优良性状 灭活,菌种的保藏,菌种保藏方法液体隔绝法冷冻干燥法低温保藏法 菌种保藏中心ATCC ( American Type Culture Collection)IFO (Institute for Fermentation, Osaka)CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Centre)ACCC (China Agricultural Culture Collection Centre)CACC (China Antibiotic Culture Collection Centre)C
26、ICC (China Industrial Culture Collection Centre),第四章 微生物基因工程,基本概念 工具酶 载体 目的基因的获得 DNA体外重组 基因的转移 工程菌的筛选,基因工程基本概念,名词：genetic engineering, DNA recombination, recombinant DNA techniques , gene manipulation, gene cloning, molecular cloning 基本材料：供体，载体，受体 一般过程：基因体外重组转入受体分离鉴定载体,工具酶,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I Ta
27、q DNA聚合酶 逆转录酶 S1核酸酶 碱性磷酸酯酶,限制与修饰,E.coli C .CEOP=1 EOP=1EOP=1 EOP=10-4.K E.coli K,限制性内切酶,一类专一性很强的核酸内切酶，包括对碱基的专一性和磷酸二酯键断裂方式的专一性。,限制性内切酶的命名与作用特点,命名：根据分离到该酶的菌株例：Hind Hemophilus influenza d 作用特点：1，识别46个核苷酸序列2，中心对称3，可产生粘性末端或平末端,几种限制性内切酶,限制性内切酶的识别序列与产生的末端,识别序列与产生的末端都相同 识别序列不同，产生的末端相同 识别序列相同，产生的末端不同 识别序列与产生
28、的末端都不同,限制酶的反应条件,Buffer NaCl Tris MgSO4 DTTL 0 10mM(pH7.4) 10mM 1mMM 50mM 10mM(pH7.4) 10mM 1mMH 100mM 50mM(pH7.4) 10mM 0* 20mM KCl 10mM(pH8) 10mM 1mM 第二活性EcoR I 当甘油10% (1220)，Mn2+代替Mg2+, pH8.5时，识别AATT,DNA连接酶,3 5 -OH P- T4: ATP, Mg+2ATP Ppi E.coli: NAD, Mg+2E E-AMPEAP-H P-AMP-,DNA聚合酶I,MW 103,000 5-3聚合
29、酶活性 5-3外切酶活性 3-5外切酶活性DNA聚合酶I 经枯草杆菌蛋白酶切得Klenow片段 MW 69,000 5-3聚合酶活性 3-5外切酶活性,Taq DNA聚合酶,耐高温的DNA聚合酶，从水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离得到。由于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)应用的不断扩大， Taq DNA聚合酶已成为分子生物学研究最重要的工具酶之一。,聚合酶链式反应(PCR), 变性 （94C） 退火（37C）5 3 35 延伸（72C） 用DNA聚合酶Klenow片段延长退火引物，由于在变性温度下酶失活，每经过一轮就需补充酶。19
30、87年耐热DNA聚合酶的发现PCR使得以实用。,PCR反应系统,DNA模板 引物（2030bp，内部无二级结构） 底物（4 dNTPs） 热稳定的DNA聚合酶,逆转录酶,发现于感染RNA病毒的动物组织，以RNA为模板合成DNA，又称依赖RNA的DNA聚合酶，常被用来合成 cDNA，是获得真核基因的重要工具酶。,S1核酸酶,作用于单链DNA的核酸酶，来自米曲霉(Aspergillus oryzae)，降解单链DNA，不降解双链DNA和DNA-RNA杂合分子，用于制造DNA平末端和去掉cDNA合成时的发夹环。,碱性磷酸酯酶,除去DNA 5末端的磷酸，以提高重组效率细菌碱性磷酸酯酶BAP （耐热）
31、小牛肠道碱性磷酸酯酶 CIP（68C可完全失活）,载体,能运载外源基因，进入受体细胞并在其中复制、转录、翻译的特殊物质。基因重组基因转移基因表达稳定性、分泌、分离纯化 能自我复制 能进行基因操作 可接纳与运载外源基因 有选择方法 有期望的性状,克隆载体与表达载体,克隆载体：拷贝数高，利于得到基因 表达载体：表达量高，利于得到蛋白这两类载体没有绝对的区别。,质粒(plasmid),一种染色体外遗传因子，为闭合的环状双链DNA分子，大小从10-1102kb不等，可以自我复制并且在细胞分裂时保持恒定地传递给子代细胞。 质粒DNA带有与质粒复制有关的基因、抗药性基因以及其他一些基因，这些基因表现为与宿
32、主有关的性质，如转移、稳定性、分泌性质、特殊的代谢途径、限制、修饰等。 拷贝数：一个细胞内质粒DNA分子的个数，与质粒复制区的结构有关。,质粒的类型,复制类型：严紧型：质粒DNA复制较严格受染色体DNA复制控制，复制时需有新的蛋白质合成，一般拷贝数较少。松弛型：质粒DNA复制不受染色体DNA复制控制，复制时不需要新的蛋白质合成，一般拷贝数较多。 接合类型（根据其引起细菌接合转移的能力）：接合(conjugative)质粒：有Tra基因，一般较大，拷贝数较少。非接合(non-conjugative)质粒：没有Tra基因。,质粒的制备,培养、收集带质粒的细胞 裂解细胞（生物、化学、物理） 除去核酸
33、外的其它细胞成分（苯酚、氯仿） 除去染色体DNA、RNA（生物、化学、物理） 浓缩、纯化,质粒载体,能在受体系统复制 有尽可能多的限制酶的单一切点 有正选择标记 分子量较小（拷贝数高、转化效率高、操作方便等） 能高效表达外源基因 在细胞分裂时保持稳定 外泌性、不可转移性等穿梭(shutle)质粒,噬菌体,噬菌体是以细菌为宿主的病毒，由遗传物质核酸与蛋白质外壳组成，只有在宿主细胞里才能繁殖。 按形状分类：蝌蚪状噬菌体(T4)、球状噬菌体(X174)、线状噬菌体(Ff) 按遗传物质分类：RNA噬菌体(MS2)、单链DNA噬菌体(M13)、双链DNA噬菌体() 按与宿主的关系分类：烈性噬菌体、温和噬
34、菌体温和噬菌体可能构建为载体,温和噬菌体的生活史,非溶源菌 溶源菌溶源化感染 复愈 诱导营养期（菌裂解）,噬菌体载体,能感染受体细胞，并能在细胞内复制 在非必须区内有多种限制酶的单切或双切位点 能容纳不同大小的外源DNA片断并包装成感染性颗粒，重组噬菌体有一定产量 能形成噬菌斑，并能通过噬菌斑的形成与表型区分重组与非重组噬菌体 生物学安全性,噬菌体的制备,培养寄主菌 接种噬菌体 固体培养：双层平板法 液体培养：至培养液澄清噬菌体DNA的制备：苯酚反复抽提（关键是得到高浓度的噬菌体）,目的基因的获得,化学合成 酶促合成cDNA合成PCR 鸟枪法,化学合成基因,用化学法合成目的基因的条件：1，已知
35、基因的核苷酸序列，或至少要知道该基因产物的氨基酸序列2，基因必须很小 举例：生长激素释放抑制因子(somatostatin)10L E.coli 发酵液 5 mg somatostatin,cDNA合成基因,mRNA5 AAAn 3 (模版) dT5 AAAn 3 (合成引物)TTTn 5逆转录酶：合成RNA-DNA碱处理：得单链cDNADNA聚合酶：合成带发夹环的双链DNAS1核酸酶：去发夹环，得双链DNA,PCR合成基因,已知基因序列 已知基因保守区序列 反向PCR RT-PCR,反向PCR,用限制酶R1切出已知序列及其上下游区（23kb），稀释 各片段自我连接成环 用在已知序列内只有单切
36、点的限制酶R2再切开 用与已知序列5端互补的引物PCR，原已知序列的两端已在中间被大量扩增限制 只能扩增紧靠已知序列两端的序列 R1应能产生大小合适并包括待扩增序列，R2应在已知序列内只有单切点,鸟枪法,用适当的限制酶将含有目的基因的供体基因组切成不同大小的DNA片段 根据需要收集一定大小的DNA片段，这些片段应比目的基因大，其中包括了带有目的基因的片段 将这些DNA片段连接到载体上，得到大量不同的重组DNA，其中包括了带有目的基因的重组DNA 将所有重组DNA转化受体细胞，得到大量不同的重组子，其中包括了带有目的基因的重组子 从大量重组子中筛选带有目的基因的重组子。由于鸟枪法克隆的基因不是专
37、一的，因此筛选时要运用一些特殊的方法与技巧,鸟枪法供体基因组的切割,选择限制酶与反应条件时应考虑：片段大小目的基因的完整性片段的末端识别6核苷酸序列 46=4096 识别4核苷酸序列 44=256,基因库,建立一定概率的基因库所需的克隆数：N = ln ( 1-P ) / ln ( 1-f )P：所需的概率f ：克隆的片段与整个基因组的长度比例：细菌基因组4000kb，克隆片段4kb ，90%概率需2301个克隆99%概率需4603个克隆克隆片段40kb ，90%概率需229个克隆99%概率需458个克隆,cDNA文库,mRNA的数量和复杂程度要远远低于基因组DNA N = ln ( 1-P
38、) / ln ( 1-n )P：所需的概率n：低丰度mRNA与总mRNA之比,DNA体外重组,易于操作 外源DNA片段可回收 插入片段与载体启动子阅读框一致,DNA体外重组的方式,平末端连接 粘性末端连接载体与外源DNA用同一限制酶酶切载体与外源DNA分别用产生相同粘性末端，但识别序列不同的两种限制酶酶切，在切载体的限制酶活性存在的条件下连接定向克隆部分补齐法HindIIIAGCT, BamHICTAG人工接头法,连接效率,连接效率：载体与外源DNA连接得到重组DNA在总连接产物中的比例 影响连接效率的因素 DNA浓度 DNA片段长度 DNA片段的卷曲度 DNA末端的状态 载体与外源DNA的比
39、例 判断连接效率的两个参数 分子内粘性末端的有效浓度 j=(3/2lb) 3/2 l: DNA片段长度, b: DNA片段卷曲度 全部粘性末端的浓度 i=2N0M10-3/ml M:摩尔浓度 j = i 自连与互连相等， j i 互连为主， j i 自连为主,基因的转移,转化（transformation)：游离DNA直接进入细胞的过程，目前主要有感受态(competance）和原生质体(protoplast)转化 转染(transfection)：游离的噬菌体DNA直接进入细胞的过程，转染率较低，一般采用感染 感染(infection)：DNA包装进病毒颗粒后进入宿主细胞的过程 转导(tra
40、nsduction)：通过噬菌体为媒介在细菌间转移遗传物质的过程 结合(conjugation)：通过细胞间接触，遗传物质从供体细胞转入受体细胞的过程 物理方法,结合转移的条件,细胞紧密接触 转移(tra)基因：至少包括12个基因，编码鞭毛和一些膜结构 泳动(mob)基因：两个区域（1）编码泳动蛋白 （2）结合泳动蛋白形成松散结合体 ，使质粒分子在这区域上打开一个缺口（nic/bom区）结合型质粒：带有(tra、mob)的质粒(tra+、mob+),结合转移的材料,受体细胞 供体细胞，含有被转移质粒（包括外源基因及mob区，无nic/bom区的质粒不能被转移）和助体质粒(helper，带tra
41、+)， helper也可是细胞 助体细胞 (helper，带tra+),结合转移的方法,滤膜杂交分别培养细胞 混合菌液，浓缩细胞 混合的浓缩菌液滴于无菌滤膜，铺于培养基平板 培养细胞，洗下菌液 稀释后置于选择性平板上培养,菌液杂交分别培养细胞 受体菌涂于培养基平板 滴5ul供体菌液于受体菌平板培养细胞 长出菌落后转移到选择性平板上培养,工程菌的筛选,初筛：筛出重组子 复筛：筛出带目的基因的重组子,琼脂糖凝胶电泳,lg = lg0 - Kr ：泳动率， 0 ：自由泳动率， ：胶浓度Kr ：与胶的性质、分子大小、构象有关的常数oc (opened circular or nicked circul
42、ar) DNAL (linear) DNAccc (covalent closed circular) DNA,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),用于分析DNA小片断、RNA、蛋白质等 凝胶的浓度与聚合 蛋白产物分析 双向(2D)电泳,分子杂交,原位杂交 印迹法(blot) Southern blot Northern blot Western blot Southern- Western blot,原位杂交法,印迹法,Southern blot：DNA经ararose电泳后转移到膜上，再与探针杂交来分析DNA的技术。由C. E. Southern发明而得名 Northern blot：RNA经
43、ararose或PA电泳后转移到膜上，再与探针杂交来分析RNA的技术 Western blot：蛋白质经PA电泳后转移到膜上，再通过免疫方法来分析蛋白质的技术Southern-Western blot：蛋白质经PA电泳后转移到膜上，再与DNA探针来鉴定蛋白质分子与DNA的特异性结合,免疫学方法,直接免疫分析 三明治(sandwich)法 ELISA(enzyme linked immuno-sorbant assay),直接免疫分析,原位裂解含Ag的菌共价结合到膜上后，直接与I125标记的Ab反应后放射自显影,三明治法,一个抗原可有几个抗原决定簇(antigenic determinant)，
44、可与一个以上抗体起反应。抗体1结合在支持物上 与细胞抽提物中的抗原结合 与标记的抗体2结合 放射自显影,ELISA(enzyme linked immuno-sorbant assay),免疫学方法与酶学方法结合的分析系统Carrier-Ag-Ab1-Ab2-Enzyme通过测酶来测定抗原，灵敏度高,基因产物分析,细胞裂解物 PAGE分析高表达产物分析 Minicell和Maxicell系统分析,DNA序列分析,A T C G3 AACGTATTGCTACTGCC 5,加减法 化学法 双脱氧法,加减法,模板 3 5引物 DNA polymerase I4 dNTP (P32标记一种)DNA polymerase I DNA polymerase I(3外切) dCTP dGTP dTTP -A +A dATP(A) A(A) A(A) A,
