1、1,第五章 病毒,前 言 1定义病毒是一类体积微小，结构简单，含一种类型核酸（DNA or RNA），必须在活动的细胞内才能生长增殖的非细胞型微生物,2,病毒的特点,个体微小，以纳米计，能通过细菌滤器，必须用电子显微镜才能改变 无细胞结构，由内部核酸和外部蛋白质组成，且核酸只有一种（DNA or RNA） 存在形式：完整有感染性的病毒粒子宿主细胞外，病毒基因组（核酸）宿主细胞内 严格的专性活细胞寄生物，不能在无生命的人工培养基上增殖 在宿主细胞协助下，以自身基因组为模板，以复制方式进行增殖 对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感 具感染性,3,第一节 病毒的大小 、形态、结构和分类 一、病毒的大小,
2、极小，以纳米计，一般为10300 nm牛痘苗病毒300250100 nm口蹄疫病毒21nm乙型肝炎病毒18 nm大肠杆菌f1噬菌体：5800 nm,4,病毒大小示意图,5,二、 病毒的形态和结构 球形，杆形，砖形，丝状，蝌蚪状,1：痘病毒；2：弹状病毒；3：副粘病毒；4：疱疹病毒；5：正粘病毒；6：冠状病毒；7：包膜病毒；8：T2噬菌体；9：腺病毒；10：呼肠病毒；11：乳多空病毒；12：小核糖核酸病毒；13：小脱氧核糖核酸病毒；14：烟草花叶病毒,6,狂犬病病毒 Rabies virus,心脏病毒 Cardiovirus: Molecular surface of Mengovirus, r
3、adially depth cued, as solved by X-ray crystallography,口蹄疫病毒 Aphthovirus: Molecular surface of Foot and Mouth Disease Virus, radially depth cued, as solved by X-ray crystallography,流感病毒 Influenza Virus,病毒的电6镜照片-1,7,病毒的电镜照片-2,H5N1型禽流感病毒,HIV Virus Particles,Hepatitis A virus reproducing inside a cell,
4、hepatitis B virus,8,烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus）,病毒的电镜照片-3,Bacteriophage,SARS冠状病毒 （SARS Coronavirus）,9,图5-11 病毒的基本结构,10,1-1 病毒形态学说语,（1）病毒粒子（viron）：成熟的，结构完整的，有感染性的病毒颗粒 （2）衣壳（capsid）：包围和保护病毒 核酸的蛋白质外壳 （3）衣壳粒（capsonmer）：构成衣壳的形态单位，由多肽链组成 （4）核心（core）基因组（genome）：病毒粒子的中心部分，由DNA或RNA 构成,11,1-2 病毒形态学说语,（5）核衣壳（
5、nucleocapsid）：病毒核心和衣壳合在一起的合称，是病毒所必须具备的基本结构 （6）包膜（envelope）：由类脂或脂蛋白组成的病毒外膜，病毒在成熟过程中的出芽方式从宿主细胞释放时获得一层外膜（含宿主细胞膜成分） （7）刺突蛋白（spike protein）/包膜子粒：来自宿主细胞膜但被病毒改造成具有其独特抗原特性的膜状结构,12,2 病毒的对称体制,根据病毒颗粒中蛋白质外壳上衣壳粒的排列方式，可将病毒分为以下几种排列： （1）二十面体对称 无包膜：脊髓灰质炎病毒、X174噬菌体、腺病毒 有包膜：疱疹病毒 （2）螺旋对称 无包膜：烟草花叶病毒（TMV） 有包膜：流感病毒，狂犬病毒 （
6、3）复合对称 无包膜：大肠杆菌的T偶数噬菌体 有包膜：痘病毒（砖块状）,13,图5-10 病毒衣壳对称型式,A：螺旋对称型，如烟草花叶病毒（TMV） B：二十面体对称型如腺病毒,14,三、 病毒的组成核酸、蛋白质 （1）核心/基因组,DNA ds-DNA（double-stranded DNA）ss-DNA（single-stranded DNA）RNA ss-RNA （-）ss-RNA(不具感染性) （-）RNA（+）ss-RNA(有感染性) （+）RNAds-RNA （+）RNA：正链RNA，指病毒复制时可以把病毒RNA直接作为m-RNA进行生物合成，即病毒RNA与m-RNA同极性 （-）
7、RNA：负链RNA，不同极性,15,（2）蛋白质衣壳 螺旋衣壳以TMV为例,由结构单位聚集形成一平坦的非螺旋的碟状体（helical capsid）,碟状体与病毒RNA连接, 95%Protein + 5% ss-RNA 碟状体形成螺旋。2130个成皮鞋状的蛋白质亚基（衣壳粒）158AA，11750 dalton亚基逆时针方向螺旋排列，共130圈,每3个核苷酸与一个蛋白质亚基相结合。,16,二十面体衣壳 （icosahedral capsids） （以腺病毒为例）,20个等边三角形平面，每面含1个六邻体（hexon）（由多肽组成的六边形），12个衣壳粒含12个顶角，每个角含1个五邻体（pent
8、on）（由多肽组成的空心的五边形）每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维240个、30条边、252个衣壳粒,17,复合衣壳 （以痘病毒Poxvirus为例）,呈砖形，在电子显微镜下不具明显的衣壳在核酸外面有双层的包膜围绕，包膜里面围绕一层可溶性的蛋白质抗原，再里面是镶嵌管状突出物的脂蛋白内膜病毒粒子的最内部是致密而呈哑铃状的DNA核心。,18,（3）包膜(envelope),由含有病毒糖蛋白（特异性抗原）的脂质双层组成，其中病毒糖蛋白系病毒基因组编码，脂质来源于宿主细胞。包膜上的刺突为： 神经氨酸酶（neuraminidase/NA）病毒吸附宿主细胞时，NA与膜发生作用。 血凝素（hema
9、glutinin/HA）凝集细血球细胞,19,图5-14 病毒包膜的形成过程,1. 核衣壳；2. 细胞膜；3. 包膜；4. 核衣壳；5. 成熟有包膜的病毒粒子,20,图5-16 流感病毒粒子的刺突,刺突(spike)病毒的包膜上具有功能性的突起物如流感病毒的刺突上含有神经氨酸酶(neuraminidase) 和血凝素(hemagglutinin) 。流感病毒吸附到宿主细胞时，NA与细胞膜发生作用，HA可促进病毒凝集红血球细胞的能力。麻疹病毒和腮腺炎病毒都具有神经氨酸酶脊髓灰质炎病毒、腺病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒等具有血凝特性。,21,四、病毒的分类 1 “真病毒”,核酸类型：DNA or RN
10、A，ds or ss等，线状或环状，分节段或不分节段 病毒的形态：球形，杆形，砖形，蝌蚪形等 壳粒的数目，排列和对称形式 包膜的有无 病毒的抗原性 宿主的种类，传播方式或媒介种类等,22,2 亚病毒（subvirus） （类病毒，拟病毒，朊病毒） (1) 类病毒（Viroid）,类病毒（Viroid）只含单独侵染性RNA组分大小：比一般病毒（真病毒）小，eg：马铃薯纺锤型块茎病（PSTD）为50nm长。成分：裸露的RNA分子。MW105 Da耐热性：至90。C仍存活传播：可通过种子传播,23,举例马铃薯纺锤型块茎类病毒（PSTV）,裸露闭合环状RNA分子 2个互补半体 179核苷酸、180核苷
11、酸122个碱基对、27个内环,（Potato spindle fuber disease，PSTV）,24,Virus and Viroid Diseases of Potato,25,（2） 拟病毒（Virusoid） 只含不具单独侵染性的RNA组分,定义：包被于病毒衣壳内的环状RNA（ss-RNA）分子RNA-2特性：只有和病毒核酸RNA-1合在一起才能感染和复制（依靠辅助病毒的存在才能复制）辅助病毒的复制不需要拟病毒的存在。拟病毒RNA复制的滚环模型 自身侵染性RNA为模板，合成多拷贝-RNA。 以-RNA为模板合成一系列+RNA，形成复制中间体RI。 从RI上形成线状ss-RNA-3。
12、RNA-3在RNA连接酶作用下环化成RNA-2（拟病毒分子）。,26,中心法则,27,（3） 朊病毒（Prion ，virino） 蛋白侵染因子,只含蛋白质一种组分 基本结构单位；朊病毒蛋白（PrP），2700030000Da，不具感染性。 朊病毒单体：由3个PrP构成，具极强的感染性。 朊病毒大约由1000个PrP组成。 举例：羊瘙痒病，疯牛病（海绵体脑）与动物饲料有关，能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性的疏水蛋白质。,28,举例：Prion （普里昂 ）,A prion short for proteinaceous infectious particle (-on by ana
13、logy to virion) is a type of infectious agent composed only of protein. They cause a number of diseases in a variety of animals, including BSE(牛海绵状脑病 ) in cattle and CJD (克雅氏病 )in humans. All known prion diseases affect the structure of the brain or other neural tissue, and all are untreatable and f
14、atal.“,傳染性海綿狀腦病TSE 发病率约百万分之一 潜伏期520年,29,五、病毒的主要类群,（1）动物病毒 脊椎动物病毒：感冒，肝炎，麻疹，水痘，腮腺炎，脊髓灰质炎，口蹄疫，鸡瘟 （2）昆虫病毒桑蚕、蜜蜂避免病毒感染，防止农林害虫，新型无污染农药 （3）植物病毒：TMV 能侵染200种植物 （4）微生物病毒：细菌噬菌体、放线菌噬菌体、真菌病毒,30,第二节 病毒的增殖,病毒的增殖过程（五个阶段）吸附(attachment or adsorption)穿入和脱壳(penetration & uncoating)生物合成(biosysthesis)装配(assembly)释放(releas
15、e),31,图5-18 dsDNA病毒增殖过程示意图,1吸附；(动画演示) 2侵入； 3脱壳； 4早期mRNA的转录； 5早期蛋白质的翻译； 6病毒DNA的复制； 7晚期mRNA的转录； 8晚期蛋白质的翻译； 9装配； 10释放,32,一、吸附（attachment ）,V + 易感宿主细胞 碰撞/静电 病毒吸附（可逆吸附）V + 易感宿主细胞 V表面特殊成分（分子）/宿主细胞膜上特异性受体 V. host cell（不可逆） eg：腮腺炎病毒的包膜与呼吸道上皮细胞的唾液酸(sialic acid，是一类近40种神经氨酸的天然衍生物 ),33,二、侵入和脱壳(penetration & unc
16、oating) 1 侵入,直接侵入V与宿主细胞的膜上的受体结合，膜开口，V核酸进入胞浆。 胞吞作用宿主细胞的吞饮作用，胞内酶消化衣壳，释放核酸。 融合有包膜病毒的包膜与宿主细胞的细胞膜融合，核衣壳进入细胞，胞内酶消化衣壳，释放病毒核酸。,34,2 脱壳,穿入时脱壳 核衣壳通过宿主细胞溶酶体酶后释放病毒核酸。 痘病毒核衣壳通过溶酶体酶使病毒释放部分病毒核酸、转录和翻译脱壳酶。,35,病毒穿入宿主细胞方式,36,隐蔽期和生物合成 （eclipse & biosynthesis）,隐蔽期（eclipse phase）V在脱壳后释放出核酸，完整的V粒子不存在，从最初失去感染性至出现V第一个粒子时期。
17、潜伏期（latent phase）V核酸侵入宿主细胞后至宿主细胞裂解的这段时期。 潜伏期 = 隐蔽期 + V颗粒从宿主细胞中释放出来所需的时间 生物合成核酸复制+蛋白质合成装配核蛋白（病毒粒子）基因组复制m-RNA的转录蛋白质的转译成熟,37,三、病毒的生物合成,根据核酸类型和mRNA合成方法可将病毒分为6组 ds-DNA病毒（痘病毒，腺病毒，疱疹病毒）ss-DNA病毒（+）DNA（eg：细小病毒，目前尚未发现-DNA virus）ds-RNA virus（eg：呼肠病毒）Rwoviruses (+)RNA 病毒（eg：脊髓灰质炎病毒，Poliovirus）(-)RNA病毒（eg：正粘病毒，流
18、感病毒等）(+)RNA逆转录病毒（eg：RNA 肿瘤病毒/RNA tumor viruses）,38,1-dsDNA(DNA)病毒的复制过程,线状或环状双链DNA，如腺病毒、疱疹病毒和痘病毒均具有线性双链DNA，乳多空病毒(Papovaviruses)具有环状双链DNA。 双链DNA病毒的复制与一般微生物相同，以半保留方式进行复制，即亲代DNA既可以作为转录mRNA的模板，又可作为合成子代DNA的模板,39,2-ssDNA(+DNA)病毒的复制过程,病毒以单链DNA作为基因组，复制时以单链DNA为模板，合成双链的DNA，然后以-DNA为模板合成mRNA和+DNA,40,3-dsRNA(RNA)
19、病毒的复制过程,41,4-ssRNA(+RNA)病毒的复制过程,42,图5-23 脊髓灰质炎病毒RNA的合成,复制中间体(replicative Intermediate，RI)是指以-RNA链作为模板，由结合在模板上的病毒蛋白g（VPg）启动，合成新的多拷贝的+RNA链，每一条新生子链藉助RNA多聚酶微弱地与-RNA模板相连，这种结构称之复制中间体。新生的+RNA 链在合成完成时从模板上脱落下来，复制型(replicative form，RF)是指复制过程中的RNA(dsRNA)形式。,43,5-ssRNA(-RNA)病毒的复制过程,44,6-ssRNA(+RNA)逆转录病毒的复制过程,45
20、,HIV(逆转录病毒),46,图5-26 不同核酸类型病毒的mRNA合成方式,47,四、装配(assembly),细胞核内大多数DNA病毒的核酸在细胞核内复制，蛋白质在细胞质中合成，最后在细胞核内装配。eg：腺病毒。 细胞质中大多数RNA病毒核酸和蛋白质的合成及装配均在细胞质中。eg：脊髓灰质炎病毒。,48,五、释放(release),裂解性释放出芽（有包膜病毒）（buding）仍在宿主细胞内，通过宿主细胞与其他正常细胞之间的接触而扩散（前病毒provirus）。,49,病毒的装配和释放-summary,装配,DNA病毒,RNA病毒,核酸产生：细胞核内,蛋白质产生：细胞质中,装配：核中完成,核
21、酸产生：细胞质中,蛋白质产生：细胞质中,装配：细胞质中完成,释放,裂解性释放,出芽释放,细胞间接触或融合,50,病毒的生活史,51,第三节 病毒的培养 一、动物接种,病毒只能在活细胞内增殖，故培养病毒必须提供活的细胞一、动物接种病毒接种敏感的实验动物，eg：幼鼠、豚鼠、大鼠、兔、猴等。,52,二、鸡胚培养,病毒在鸡胚上增殖的现象包括组织坏死、出现痘疤、血凝试验阳性等孵育715天受精卵注射器接种受精卵培养4872小时，使病毒增殖分离病毒,53,图5-27 鸡胚构造和病毒接种部位示意图,54,三、细胞培养（cell culture）,获得单个多分散的细胞机械法或胰蛋白酶消化，eg：人成纤维细胞，新
22、生瘤细胞，猴肾细胞等。 传代细胞系能在体外持续培养增殖，贴壁型/悬浮型。,55,四、病毒在细胞内大量增殖的现象 1-细胞病变效应（cytopathogenic effect，CPE）,病毒DNA编码一种能抑制宿主细胞RNA和蛋白质合成的蛋白质，宿主细胞的大分子合成受到抑制，导致死亡CPE现象为：变圆，坏死，溶解，脱落，凝集。,56,图5-28 麻疹病毒（measles virus）感染的细胞病变效应,细胞病变,57,2-红细胞吸附,被感染的宿主细胞膜上表达病毒特异性的血凝素, eg：流感病毒为病毒的特异性抗原在宿主细胞上的表达导致感染细胞能吸附动物红细胞,红细胞,红细胞与血凝,58,3-被感染
23、的细胞出现包涵体 4-干扰现象感染后viro host cell 能干扰随后进入的病毒的增殖。,59,病毒感染细胞后形成的包涵体,Cells infected with adenovirus,inclusions within the nuclei,(a)：牛痘苗病毒感染后在细胞浆内形成的嗜酸性包涵体（顾氏小体）；(b)：呼肠病毒感染后在核周胞浆内形成的嗜酸性包涵体；(c)：狂犬病毒感染后在细胞浆内形成的嗜酸性包涵体（内基小体）； (d)：单纯疱疹病毒感染后在核内形成的嗜酸性包涵体； (e)：腺病毒感染后在核内形成的嗜碱性包涵体；(f)：麻疹病毒在核内和胞浆内形成的嗜酸性包涵体,60,5-细胞
24、代谢改变-1,肿瘤病毒感染细胞后，一般不导致死亡，而是引起细胞性质的变化，称为转化(transformation)，并能将所获新特性传于后代。这种遗传学的稳定变化属于恶性转化。,61,5-细胞代谢改变-2,转化细胞的关键特征是： 失去接触抑制(正常细胞相接触时即停止生长)； 高度密集生长，即所谓“疯长”； 出现病毒特异性抗原；肿瘤抗原(tumor antigen，TA)和肿瘤特异性移植抗原(tumor specific transplantation antigen，TSTA)；,62,5-细胞代谢改变-3, 转化细胞移植易感动物，引起肿瘤； 增加植物血凝素的凝集能力； 引起形态学变化。在转化
25、细胞中，病毒特异性核酸已整合到宿主细胞的基因组中去。DNA病毒的核酸可直接整合,63,第四节 干扰现象和干扰素 一、干扰现象-1,有些病毒感染宿主细胞后，不一定会引起细胞病变，用显微镜观察不到细胞有病毒感染的痕迹，但一种病毒感染宿主细胞后，可抑制另一种病毒的增殖，这种现象称之为干扰现象（interference）。如鼻病毒感染的细胞可干扰副流感I型病毒的增殖，从而不会产生宿主细胞感染流感I型病毒后出现的红细胞吸附现象。,64,干扰现象-2,干扰现象没有特异性，可以发生在异种病毒之间，也可发生在同种异型病毒株之间，甚至同一种病毒的无毒株与有毒株之间、灭活病毒与活病毒之间也可发生干扰现象。可发生在
26、动物机体水平、组织培养细胞。不是说任何病毒之间都有干扰现象，例如也有两种病毒感染同一细胞后，病毒在其中的增殖情况宛如单纯病毒感染时那样良好(如牛痘苗病毒与疱疹病毒，麻疹病毒与脊灰病毒)。在病毒疫苗的制备和预防接种上有重要意义。如病毒的减毒活疫苗能阻止毒力较强病毒株的感染；机体被毒力较弱的呼吸道病毒感染后，可在一定时间内对另一些病毒不易感。,65,二、干扰素（interferon，IFN）- 1-定义,1957年Isaacs和Lindenmann在研究病毒之间的干扰现象时，发现的具有抗病毒活性的物质。IFN除不仅具有抗病毒增殖活性外，还有抑制细胞分裂、免疫调节、抗肿瘤等多种生物学活性。干扰素是机
27、体细胞受病毒感染或机体在其他IFN诱生剂作用下由细胞基因组控制产生的一类蛋白质，具有抗病毒增殖等多种生物学活性，其活性的发挥又受细胞另一基因组的调节和控制。干扰素是一种分泌到细胞外的蛋白质，其本身并不能直接杀灭病毒，而是通过诱生其他效应蛋白质产生抗病毒活性，具有多方面生物学功能，且为广谱抗病毒活性物质。,66,2-干扰素种类,IFN-：由白细胞产生 IFN-：由成纤维细胞产生 IFN-：由活化的T淋巴细胞产生,67,3-干扰素的性质,干扰素是一组可溶性的糖蛋白分子，分子量约在1500025000之间，无抗原性的物质。 抗病毒范围广 抗病毒作用有种属特异性（同种细胞高于异种细胞，人，灵长类动物产
28、生的IFN才对人起作用） 病毒的增殖有干扰作用 介质对病毒的蛋白质合成起作用 免疫调节和抗肿瘤作用,68,干扰素性质-2,69,4-干扰素的产生和作用机制,宿主细胞基因组中存在着IFN基因，但受阻遏物和操纵子的控制，IFN基因处于被抑制的状态，干扰素基因不能转录和翻译成蛋白质，从而不产生IFN。当病毒感染(或在其他IFN诱生剂作用下)，IFN阻遏物失活，IFN基因去抑制而激活，通过转录和翻译合成了IFN蛋白（图5-31）。IFN作用同一细胞的另一组基因和(或)迅速释放到细胞外作用于同种细胞膜上的IFN受体，细胞内抗病毒蛋白(antiviral protein，AVP)基因去抑制而激活，转录并翻
29、译产生几种AVP，最终抑制病毒的增殖。,70,图5-31 干扰素系统示意图,1. 细胞； 2. 抗病毒蛋白基因 3. 细胞核； 4. 干扰素基因； 5. 干扰素； 6. 细胞； 7. 细胞核； 8. 抗病毒蛋白基因 9. 几种抗病毒蛋白 10.病毒颗粒； 11. 几种抗病毒蛋白 12. 病毒基因组； 13. 新病毒颗粒； 14. 病毒增殖抑制,71,图5-32 IFN诱生的AVP抗病毒作用,72,三、IFN诱生剂,poly I：C（多聚肌苷酸多聚胞苷酸） 细胞内繁殖的微生物LPS，真菌多糖促有丝分裂剂（植物血凝素）,73,五、IFN的制备及应用,细胞诱生基因工程抗病毒，抗肿瘤,74,第五节 抗
30、病毒化学疗剂 一、病毒对理化因素的抵抗力,（1）温度一般：60，30 min。 乙肝病毒：60，60 min。 病毒保存:-70 数月,-196数年。 （2）UV形成胸腺嘧啶二聚体。 （3）X-ray蛋白质和核酸中共价键断裂。 （4）pH 68 范围内稳定。,75,2 化学因素对病毒的作用,KMnO4 次氯酸 碘酊 甲醇 乙醇 环氧乙醇等。,76,二、抗病毒的化学治疗剂,1 抑制病毒穿入与脱壳的药物盐酸金刚丸胺（抑制甲型流感病毒） 2 抑制病毒核酸合成核苷类药物ara-C，ara-A ，无环鸟苷（阿昔洛韦），DUFR，三氮唑核苷（病毒唑），ddC，ddI，AZT（叠氮胸苷）抑制HIV（鸡尾酒疗
31、法的主要药物）。 3 中药板蓝根,77,图5-33 抗病毒药物的化学结构,78,第六节 噬菌体,噬菌体(phage, bacteriophage) 定义：感染细菌、放线菌、真菌的病毒对宿主细胞有高度特异性多数分布在人和高等动物的肠道排泄物或污染的水源和其它材料中大肠杆菌噬菌体(coliphages)、金黄色葡萄球菌噬菌体(staphylophages)、伤寒杆菌噬菌体(typhoidphages),79,一、噬菌体的形态与结构 1-形态,蝌蚪形 微球形 丝状,Bacteriophage-2,Bacteriophage-1,噬菌体感染细菌,Bacteriophage-3,80,2-大小,蝌蚪形噬
32、菌体：头部80100纳米二十面体对称尾部100200纳米。,81,3 化学组成,（1）蛋白质：头部（外壳）、尾部 （2）核酸（3.6103 bp直到2.5105 bp ）噬菌体核酸多数是双链、线状DNA (T1，T4，T7，噬菌体等)双链环状DNA (PM2)单链环状DNA (X174，fd等)双链线状RNA (Pseudomonas phaseolica，噬菌体6)单链线状RNA (Q，f2等),82,4 结构,头部 尾部 尾领、尾髓、尾鞘、尾板、尾刺、尾丝 6类噬菌体的特征与结构 大肠杆菌T系噬菌体 （T1T7） T偶数噬菌体（T2，T4，T6）（T-evev Phage）,83,图5-3
33、5 大肠杆菌T4噬菌体结构,大肠杆菌T4噬菌体是蝌蚪形的典型代表头部为稍长的二十面体对称型，大小约为80 nm110 nm，内部含有双链、线状DNA分子，分子量为1.12108 Da；尾部由尾领(collar)、尾鞘(sheath)、尾髓(tail core)、尾板(base plate)、尾刺(spike)和尾丝(tail fibers)组成长短约为110 nm20 nm，尾丝可伸展，幅度可达140 nm。,84,二、噬菌体的增殖 1 吸附,（1）噬菌体尾部（尾丝的尖端）与宿主细胞壁表面上的受体发生特异性结合，刺突、尾板固定于细胞表面。 脂多糖（LPS）T3、T4、T7 脂蛋白（T2、T6）
34、 bacillus subtilis SP-50 噬菌体的吸附位点是磷壁酸 （2）吸附在细菌的鞭毛上 （3）吸附在性菌毛上（大肠杆菌丝状噬菌体M13）,85,图5-36 大肠杆菌噬菌体吸附宿主细胞的电镜照片,86,2 穿入（侵入）,蝌蚪形噬菌体的尾部吸附在细胞表面，通常将核酸注入细胞，蛋白质留在细胞外。大肠杆菌T-系噬菌体能水解细菌细胞壁肽聚糖，其作用相似于溶菌酶，使细胞壁产生小孔，可以导致细菌细胞内容物漏出。,87,3 生物合成（以ds-DNA的T4噬菌体为例） （1）早期转录,以噬菌体DNA为模板，利用细菌（宿主）的RNA合成噬菌体mRNA。从而进一步合成早期蛋白质（次早期mRNA聚合酶，
35、更改蛋白等）。 更改蛋白：其本身无RNA聚合酶功能，但可与细菌细胞内原有的RNA聚合酶结合以改变后者的性质，使其改造成只能转录噬菌体的次早期基因。,88,（2）次早期转录、（3）晚期转录,（2）次早期转录利用噬菌体RNA聚合酶或更改蛋白（T4噬菌体）合成噬菌体次早期mRNA。 以次早期mRNA为模板合成DNA合成酶，DNA分解酶，晚期mRNA聚合酶等。 （3）晚期转录合成晚期mRNA 噬菌体DNA 结构蛋白，溶菌酶等,89,图5-38 T4噬菌体的复制过程,复制循环仅需20 min 30 min 与其它病毒比较，除早期转录，晚期转录外还增加了次早期(delayedearly)转录的阶段。,90
36、,4 装配（动画演示）,DNA 分子的缩合，通过衣壳包裹DNA而形成头部。 尾丝和尾部的其他部件独立装配完成 头部与尾部相结合 最后装上尾丝,91,图5-39 T4噬菌体的装配过程,92,5 释放,水解细胞膜的脂肪酶和水解细胞壁的溶菌酶的作用，促使细胞裂解。丝状噬菌体成熟后不破坏细胞壁（eg：f1，fd，M13）衣壳蛋白合成后沉积在细胞膜上，噬菌体成熟后并不破坏细胞，而是一个个噬菌体DNA外出穿过细胞膜时才与衣壳蛋白结合,93,三、噬菌斑及噬菌体效价 1 噬菌斑（plague）,在固体培养基平板上，噬菌体裂解宿主菌而形成的空斑,94,噬斑形成单位PFU、效价或滴度PFUm1,不同噬菌体噬菌斑形
37、态和大小各有不同个噬菌斑就是一个噬菌体裂解细菌的结果，噬菌斑数目即为噬菌体的数目。连续稀释法在液体培养基中测定，以最大稀释度还能溶解相应细菌判为该噬菌体的效价，即噬斑形成单位(phqge forming unit，PFU，PFUm1)，又称为效价或滴度（titer）。,95,2 噬菌体效价测定方法双层琼脂平板法,（1）噬菌体适当稀释 （2）地层平板（2%琼脂培养基78ml） （3）上层平板噬菌体稀释液 0.1ml 对数生长期宿主菌悬液 0.2ml 0.8%琼脂培养基（55），35ml （4）37，812h （5）观察噬菌斑,96,3 噬菌体的分离,（1）对数生长期宿主细胞 （2）取样加入宿主细
38、胞悬液，培养。 （3）稀释 （4）测PFU/ml（噬菌斑形成单位）,97,噬菌体分离,可疑材料接种培养过滤除菌 滤液（含多种噬菌体）加指定宿主菌培养特定噬菌体 培养液变澄清-分离噬菌体成功溶菌空斑实验空斑接种入相应宿主菌液培养 纯噬菌体,98,四、一步生长曲线 (one-step growth curve ),将敏感宿主菌培养物与相应噬菌体混合一定时间，加入抗噬菌体血清消除过量的游离噬菌体。培养后，每隔一定时间取样，接种含宿主菌平板，测定噬菌斑数。以培养时间为横座标，以噬菌斑数为纵座标作图，绘制的曲线即噬菌体的一步生长曲线。,99,1 测定方法,（1）用噬菌体的稀释液去感染高浓度的宿主细胞（敏
39、感菌）以保证每个细胞至多不超过一个噬菌体吸附。 （2）经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的噬菌体的抗血清，以中和未吸附的噬菌体。 （3）用保温的培养液稀释上述混合液，同时可中止抗血清作用。 （4）培养（eg：37） （5）定时取样，测噬菌体效价。 （6）以噬菌体效价为纵坐标，培养时间为横坐标，绘图一步生长曲线,100,2 三个阶段,潜伏期(1atent period)噬菌体感染宿主细胞后到释放前的这段时间；突破期(rise phase)或裂解期菌体破裂，噬菌体数目增加，直至达到最高值；平稳期（plateau）突破期后噬菌体数目不再增加，达到稳定值。平均收获量(average yield of
40、phage)或爆破量(burst size)每个被感染的细菌释放的新的噬菌体平均数。,101,3 人为裂解（用氯仿）,隐晦期出现，是噬菌体开始装配的时期。,102,五、噬菌体与宿主细胞生活周期 1 温和噬菌体、烈性噬菌体、前噬菌体概念,（1）烈性噬菌体感染宿主细胞，增殖，宿主细胞裂解，死亡。 （2）温和噬菌体噬菌体DNA整合入细菌染色体中，以前噬菌体形成一代代传下去。 （3）前噬菌体整合入宿主细胞的DNA核酸。,103,2 溶源菌,（1）定义指在核染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。 （2）特点自发裂解，几率10-210-5。 （3）诱导溶源菌在外界理化因子的作用下，发生高
41、频率裂解的现象。eg：UV，X-ray，DNA合成的抑制剂丝裂酶素等。 （4）免疫性任何溶源菌对以感染的噬菌体外的其他噬菌体（温和或烈性）都具有抵制能力。（5）复愈在增殖过程中丧失前噬菌体，几率10-5。,104,图5-42 温和噬菌体和宿主的生活周期,105,噬菌体生活周期,烈性噬菌体 吸附穿入 增殖 成熟裂解温和噬菌体 整合 同步复制 自发或诱导 （自发几率10-2-10-5）,裂解性循环,溶源性循环,多次循环传代,106,3 溶源转变溶源菌表型发生变化,白喉棒杆菌（不产毒）温和噬菌体产毒株肉毒梭菌温和噬菌体产C型或D型毒素,107,4 检验溶源菌的方法,（1）少量溶源 + 大量敏感指示菌倒平板/培养溶源菌周围形成特殊噬菌斑（透明的裂解圈）； （2）实验菌 + 宿主菌 噬菌斑实验菌 + 宿主菌 诱导 噬菌斑比较得出实验菌是否为溶源菌。,108,六、噬菌体的应用,1 细菌的分型，鉴定。 2 分子生物学研究工具载体。 3 发酵工业防止phage污染，选育抗噬菌体菌株。,
