1、Novobio Custom ServicesC1第一部分 RNAi服务2RNA干扰现象是 1990年由约根森（ Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的研究中发现的1998年，安德鲁 法厄（ Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（ C.elegans）中进行反义 RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链 RNA相比正义或反义 RNA显示出了更强的抑制效果RNAi干扰机理3长链三种 RNAi干扰技术手段4RNAi的应用 高通量的研究基因功能 基因敲除 基因治疗 基因表达调控51.1 siRNA合成服务 化学合成的 siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或
2、者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。6偌百优势siRNA oligo均由 HPLC纯化， 100除去尚未配对的单链多种修饰选择：末端修饰（ FAM， Biotin等），碱基修饰（ 2-OMe）7化学合成优势操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行 siRNA有效片段的筛选 。服务流程 客户提供： siRNA oligo的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计），以及技术要求（包括 OD和 nmols的精确数量、纯化类型、修饰要求等）根据序列信息，进行化学合成；
3、 HPLC纯化；经过分光光度计精确定量 冻干处理 我们提供：长度 19-23碱基 /链的 siRNA，产品形式为退火的双链 RNA的冻干粉，有以下选择 普通 siRNA 化学修饰 siRNA利用 2-Fluoro或 2 OMe修饰以提高 siRNA在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通 siRNA；荧光标记 siRNA siRNA对照，包括普通阴性对照（与目的靶细胞中所有基因无同源性的阴性对照）、荧光标记的阴性对照（方便在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件）和 siRNA阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在实验方法中您的转染、 RNA提取物和检测方法是可靠的；常用的 siRN
4、A阳性对照有LaminA/C， Beta-Actin， P53， GAPDH等）81.2 RNAi载体构建服务使用 RNAi载体的优势 实现瞬时或稳定的靶标抑制 在任何类型的细胞（甚至是难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞）中执行 RNAi 通过诱导型 RNAi表达来调控基因抑制 选择稳定表达 RNAi序列的纯细胞群 通过组织特异性启动子控制体内基因表达9三种载体构建方式 shRNA干扰载体构建： miRNA（ microRNA）干扰载体构建 shRNAmir干扰载体构建10shRNA expression vectors11利用 miRNA产生 RNAi效果诺百优势 质量保证：针对一个基因的不
5、同位置设计 4条 miRNA序列，在转染效率 80%的前提下，我们保证至少有 2个克隆可以达到至少 70%转录水平的 knockdown。 多种平台载体可供选择： shRNA载体， miRNA干扰载体（第二代干扰载体）， miR-shRNA载体（第三代干扰载体） 利用绿色荧光蛋白（ GFP）和感兴趣的 RNAi序列协同表达，方便追踪 可将多个 RNAi序列串联到同一表达载体中并同时表达，进行多个靶基因的同时干扰12服务流程 客户提供：基因的 Accession Number 针对特定基因，设计 RNAi序列；合成该序列并退火生成双链 DNA 将 DNA与 RNAi载体相连，连接物转化大肠杆菌
6、测定全长序列以鉴定序列的正确性；制备甘油菌 提供数据分析和报告给客户 我们提供：构建好的 RNAi表达载体和相应的甘油菌131.3 RNAi干扰服务 在 RNAi研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适化，可以获得高敲除效果。因此，为了将 RNAi研究成功导入，需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。我们采用实时荧光定量 PCR或免疫蛋白印迹法分析这些 RNA干扰序列对靶基因蛋白表达水平的抑制的有效性14诺百优势 质量保证：针对某靶基因设计的 3条 siRNA可保证其中两条的 Knockdown效率达到 70%（在转染效率大于 80%的情况下）；针对某靶基因的 4条 miRNA序列，在
7、转染效率 80%的前提下，我们保证至少有 2个克隆可以达到至少 70%转录水平的 knockdown。 可针对客户选择的靶细胞系，进行转染条件的优化服务，以确定所选择的细胞系的有效转染条件 。 15服务流程 客户提供选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤；选择的靶基因 cDNA的序列号；抗体（如果需要 Western blot检测）对需要用于转染的细胞进行细胞培养 对需要用于转染的细胞进行细胞培养； 优化转染条件：在荧光显微镜下检测 Fluorescent Oligo或可表达 GFP的干扰载体的荧光强度，评估转染效率 为靶基因设计一组 siRNA双链或干扰载体 采用荧光定量 RT-PCR或免疫
8、蛋白印迹评估转染后某一时间点靶基因 RNA水平或蛋白水平的变化 可利用抗生素来筛选稳定表达 shRNA或 miRNA的细胞株 我们提供：转染效率分析； Knockdown分析，包括实时荧光定量 PCR检测、 Western Blot图片等16第二部分 慢病毒的制备和慢病毒 RNAi干扰服务17| Life Technologies Proprietary 615-623.neuronal cell 2002. Nature 420(6911):74-78.B cell 2003. J Exp Med 198(4):581-589.human lens epithelial cell 2004.
9、 Proc Natl Acad Sci U S A 101(26):9654-9659.adipocyte 2005. Mol Cell Biol 25(21):9383-9391.bone marrow cells 2003. J Biol Chem 278(40):39068-39075.HCA-7 cells (human colon cancer) 2003. J Biol Chem 278(21):19396-19405.Primary human leukemia cells 2001. Haematologica. 86(1):13-16.Application II Anima
10、l Transgenesis Implemented successfully in mice，rats, pigs, chickens, cows, domestic cats, prairie voles, primates, etc. Higher transgene expression level Better survival rate Can be tissue-specific and/or conditional expression| Life Technologies Proprietary 2006 Mol Ther 13: 484493; 2006. Hum Gene
11、 Ther 17: 19.)Liver, Heart, Pancreas ( 2006. Clin Sci. 110:37-46)Kidney, muscle (2004. Mol Ther 10:768-779)Vaccine (2009. Vaccine 27:3443-3449; 2008. PLoS One 3: e3973)| Life Technologies Proprietary thus, Rev makes sure that the viral RNA (unspliced viral mRNA) is exported into the nucleus.The Gag
12、protein recognizes the Psi element in the viral RNA; thus, only viral RNA is packaged and no other mammalian RNA.The expression of the gag-pol sequence is rev dependent, thus preventing the expression of gag-pol in the absence of rev. Invitrogen Proprietary & ConfidentialLentivirus PackagingStep 1:
13、Co-transfect retroviral packaging vectors and pLENTI6.3/V5 vector with gene of interest into 293FT cells. pLP1 pLenti6.3-GOIpLP/VSV-GpLP2 293FT CellsInvitrogen Proprietary & ConfidentialLentivirus PackagingpLP/VSV-GpLP1pLenti6-GOIpLP2Step 2: Viral rev protein exports the viral RNA genome (carrying t
14、he gene of interest) out of the nucleus.1. Envelope protein is made and becomes studded in the cells membrane.2. pLP1 and pLP2 make gag/pol and rev. 3. In the nucleus, Pol transcribes pLenti into viral RNA (5 LTR-3 LTR).4. Rev transports the viral RNA w/ goi from nucleus to cytoplasm. Rev recognizesthe viral RNA via its RRE (Rev response element).RevgoigoiRevGag PolEnvelope protein
