1、实验六 纸层析法观察转氨基作用【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用09 救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336室温：28（一）实验目的：1、学习氨基酸纸层析的基本原理。2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。（二）实验原理：转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的 -酮酸与-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的 氨基转移到另一 酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应： 酮戊二酸 + 丙氨酸 ALT谷氨酸 + 丙
2、酮酸本实验以丙氨酸和 -酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值 Rf 表示：物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值 Rf 也
3、相对稳定，因此在同一层析体系中可用 Rf 值来鉴定被分离的物质。（三）实验材料与仪器：试剂： 1、0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液。2、0.2mol/L Na2HPO4溶液 81ml 与 0.2mol/L NaH2PO4溶液 19ml 混匀,用蒸馏水稀释 20 倍。3、0.1mol/L 丙氨酸溶液称取丙氨酸 0.891 克,先溶于少量 0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液中,以 1.0 N NaOH 仔 细调至 pH7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至 100ml。4 、0.1mol/L酮戊二酸称取 酮戊二酸 1.461 克,先溶于少量 0.01mol/L pH 7.4磷酸盐
4、缓冲液中，以 1.0 N NaOH 仔细调至 pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至 100ml。5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸 0.735 克,先溶于少量 0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓冲液中，以 1.0 N NaOH 仔细调至 pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至 50 ml。6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮 0.5 克于 100 ml 丙酮中溶解。7、层析溶剂：将重蒸过的酚 2 份和水 1 份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置 24 小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。仪器：玻璃匀浆器、10ml 试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、 37恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘
5、箱、手术剪刀、分液漏斗。 （四）实验步骤: 1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝 0.5 克,剪碎后放入匀浆器,加入冷 0.01mol/LpH 7.4 磷酸盐缓冲液 1.0 ml,迅速研成匀浆， 用上述缓冲液 4.5ml 混匀备用。2、 酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管） 、2（对照管） ，各加肝匀浆 0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热 10 分钟，取出冷却。（2）各加 0.1mol/L 丙氨酸 0.5 ml, 0.1mol/L-酮戊二酸 0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液 1.5 ml,摇匀。（3）37保温， 30 分钟后取出，保温完毕。（4）把测定管放沸
6、水浴中煮 10 分钟，取出后冷却，过滤。3、层析（1）取圆形滤纸一张（直径 9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约 1 cm 为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点 2、4处。把测定液、对照液分别点在原点 1、3 处。注意斑点不宜过大（应在直径 0.5cm 以下） 。在第一次点样点干后，再在原处同样点第 2 次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细） ，再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿
7、盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约 1cm 时，约 25 分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。（5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴 0.5茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算 Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。（五）实验结果记录：图（1）表格（1）（6）实验讨论：1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据 Rf 值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质 b 为谷氨酸，则未知溶质a 为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。4、点样点不宜过大，直径小于 0.5cm.2010 年 9 月 19 日点样溶液 色斑个数 溶质中心到原点中心的距离溶质前缘到原点中心的距离Rf 值未知溶质 a 1.50cm 2.50cm 0.6测定管上清液 2未知溶质 b 0.40cm 2.50cm 0.16丙氨酸 1 1.30cm 2.20cm 0.6对照管上清液 1 1.50cm 2.50cm 0.6谷氨酸 1 0.40cm 2.20cm 0.16
