1、 实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝 G-250法（Bradford 法）测定蛋白质含量定 一 实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量。二 实验原理考马斯亮蓝 G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在 595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 结合在 2min 左右的时间内达到平
2、衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法是 1976 年 Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法还高 4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为 01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三 实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝 G-250 的配制：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL90乙醇中，加入 85（WV）的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
3、四 实验步骤标准曲线制作：取 6 支 10mL 干净的试管，按表 1 取样。摇匀后放置 2min ，用 1cm 光经的比色杯在 595nm 波长下比色，记录测定的光密度 OD595nm，并做标准曲线。表 1 低浓度标准曲线制作管号 0 1 2 3 4 51mg/ml 标准蛋白 (ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝 G-250（ ml）5 5 5 5 5 5蛋白浓度（mg /ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10OD595nm 0 0.339 0.491 0.601 0.775 0
4、.799上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7329x+0.11422未知蛋白质浓度的测定另取 2 支 10mL 试管，按下表取样。吸取测定液 0.1mL，蒸馏水 0.9 mL 放入试管中，加入 5mL 考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂，充分混合，放置 2min 后用 1cm 光径比色杯在 595nm 下比色，记录光密度 OD595nm，并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量 X（g）。以标准曲线 0 号试管做空白。五 实验结果待测样品的吸光度 1 为 0.240，待测样品的吸光度 2 为 0.266，平均值为0.253。代入标准曲线得知 x 为 0.0018，所以浓度为 0.0
5、18 mg /ml。六、实验分析（一）经测量得每毫升测定液中蛋白质的含量很低，是样品本身蛋白含量少还是实验操作造成，还需进一步分析。（二）考马斯亮蓝法测定未知蛋白浓度：优点：1、灵敏度高；2、测定快速、简便，只需要加入一种试剂；3、干扰物质少。缺点：一般分光光度法都有较大的机器误差（重复性较差），为了数据准确，需要每次进行标准曲线的测定。七、注意事项1.在测量前应把分光光度计预热半小时，打开开关时，先确定开关按钮的置，切不可凭直觉乱摸。2.称量样品前，电子天平要归零，称量时要精准。3.溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。4.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。5.在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。
