1、微生物学,集宁师范学院 生物系 生化与分子生物学教研室 贺 番,第四章 微生物的营养,（Microbial Nutrition）,本章主要内容,第一节 微生物的6类营养要素 （微生物吃什么？） 第二节 微生物的营养类型 第三节 营养物质的跨膜运输 （微生物怎么吃？） 第四节 培养基（怎么给微生物做饭？）,第一节 微生物的6类营养要素,一、微生物细胞的化学组成 二、六大营养要素及其生理功能,微生物细胞中几种主要元素的含量（干重）,微生物细胞的化学组成,（三）分析细胞有机、无机成分的方式,有机成分：1.化学法直接抽提-定性、定量分析 2.破碎细胞，获得亚细胞结构-化学分析无机成分：细胞-550-灰
2、分-定性、定量分析,二、营养物质及其生理功能,碳源 氮源 无机盐 生长因子 水 能源,（一）、碳源（Carbon source）,微生物的碳源谱,微生物工业发酵中用做碳源的原料,传统种类：糖类（单糖，饴糖）淀粉（玉米粉、山芋粉、野 生植物淀粉等）麸皮、各种米糠等。 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2。,现有700多万中有机物，微生物都能够分解、利用,（二）氮源（Nitrogen source ）,硝酸盐NO3 NH4+,迟效氮源：蛋白氮通过水解，降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，有利于机体生长。 速效氮源：无机氮源或蛋白质降解产物以直接被菌体吸收利用，有利于代谢物形成。,铵 盐 氨基酸
3、入胞 细胞物质 蛋白胨,豆 饼 蚕蛹粉,分解 入胞 细胞物质,诱导酶,诱导酶,生理酸式盐和生理碱式盐,（三）无机盐（inorganic salt）,无机盐的生理功能：,无 机 盐,大量 元素微量 元素,一般 功能特殊 功能酶的激活剂（Cu2+、Mn2+、Zn2+等）特殊分子结构成分（Co、Mo等）,维持渗透压 生理调节物质 酶的激活剂pH的稳定,化能自养菌的能源(S、Fe2+、NH4+、NO2-) 无氧呼吸时的氢受体(NO3-、SO42-),细胞内一般分子成分(如P，S，Ca，Mg，Fe等),无机元素的来源和功能,（四）生长因子（growth factor）,根据微生物对生长因子的需要分为,1
4、. 野生型 (wild type) 原养型不需要生长因子而能在基础培养基上生长的菌株 2. 营养缺陷型 (auxotroph)由自发或诱发突变需要提供特定生长物质才能生长的菌株,分类: 1、嘌呤和嘧啶(合成核苷酸）2、氨基酸（合成蛋白质）3、维生素（合成酶及辅酶的功能团）,（五）水（water）,总结水的生理功能： 1.细胞组分（70-90%） 2.良好的溶剂和化学反应的介质 3.调节温度 4.维持压强 5.有利于生物大分子结构稳定,水在细胞中的两种存在形式： 结合水和游离水，结合水难以利用,为了表示微生物生长与水的关系，有时也常用相对湿度（RH) 的概念( w 100= RH ) 通常也用测
5、定蒸气相中相对湿度的方法得知溶液或物质的水活度。,（六）能源 （energy source）,概念：能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质。,能源谱,化学物质 (化能营养型）,辐射能 （光能营养型）,有机物：化能异氧微生物的能源,无机物：化能自氧微生物的能源,：光能自氧和光能异氧微生物的能源,1、根据生长所需要的营养物质的性质（碳源）异养型生物：生长时以复杂有机物质为营养物质 （如：动物以及大多数微生物） 自养型生物：生长时以简单无机物质为营养物质 （如：植物及少数微生物） 特点:(1)不需要有机养料,可生活在完全无机环境中。(2)将无机碳源转化为细胞的有机物。动物异养型生物植物、微生物
6、异养型和自养型多数微生物异养型，少数微生物自养型。,自养微生物：不依赖任何有机营养物即可正常生活的微生物。 异养微生物：至少需要提供一种大量有机物才能满足其正常营养要求的微生物。 （碳源必为有机物，氢供体为有机物，能源可为氧化有机物也可以是利用光能。）,关于营养类型的另一种定义：,氢供体不同 有机型生物：还原CO2时氢供体为有机物质 无机型生物：还原CO2时氢供体为无机物质,微生物的四大营养类型,4、化能异养型微生物 多数微生物,能量和碳源来自同一种有机物。腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。 寄生型微生物：寄生在活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。 兼性腐生型或兼
7、性寄生型：存在于寄生与 腐生之间的中间过渡类型微生物。,光能 化学能,碳源,能源,自养 异样,氢供体,腐生 寄生,摄取方式,野生型 缺陷型,生长因子,有机 无机,总结微生物的分类方法,要 点,第三节 营养物质的跨膜运输,主要内容 营养物质进入细胞的方式 每种方式的特点 四种方式的区别,Special Cases 1.入胞 Endocytosis 2.出胞 Exocytosis,原生动物胞吞、胞饮式营养物质的运输,物质 运输 类型,无载体蛋白,有载体蛋白,单纯扩散,不耗能,耗能,促进扩散,构象 不变,构象 改变,主动运输,基团移位,营养物质的跨膜运输,营养物质的跨膜运输,被动运输：一种简单的物质
8、跨膜运输方式。 特点：1、整个运输过程不需要能量2、动力是细胞膜内外的物质浓度差3、营养物质顺浓度梯度由高向低扩散4、运输的营养物质分子结构不发生变化 分类：单纯扩散促进扩散,1、单纯扩散 (simple or passive diffusion),概念：被输送的物质，靠细胞内外浓度为动力，以透析或扩散的形式从高浓度区向低浓度区的扩散。 动力：浓度差 物质：小分子，溶于水 方向：单向，由高到低,特点： 1、扩散是非特异性的营养物质吸收方式。 2、在扩散过程中营养物质的结构不变。 3、物质运输的速率慢：速率与浓度差有关，至胞内外物质浓度相同。 4、无载体参与；不需要代谢能量。 5、可运送的养料有
9、限。 影响因素：温度、pH值、离子强度等。,流动方向：向高盐浓度流动,单纯扩散模式图,细胞膜外,细胞膜内,细胞膜,概念：营养物通过与细胞膜上载体蛋白（也称作透过酶permease）的可逆性结合来完成物质的运输和加快传递速度。多见于真核微生物的营养吸收与代谢。 动力：浓度差 方向：单向，由高到低 载体蛋白：诱导产生,与运输对象具有专一性 物质：K+、Na+、CI-,2、促进扩散 (facilitated diffusion/transport),特点： 1、营养物质分子结构不变 2、不耗能，不能逆浓度运输 3、运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定 4、需要细胞膜上的载体蛋白参与 5、被运输物质与
10、载体蛋白高度特异 6、载体蛋白有限，会出现饱和效应,细胞质膜上的跨膜蛋白,单纯 扩散,促进 扩散,载体蛋白是跨膜蛋白。 在整个过程中其构象发生两次改变。,促进扩散模式图,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,细胞膜外,细胞膜内,细胞膜,3、主动运输 (Active transport),概念：在代谢能的推动下，通过膜上特殊载体蛋白，逆浓度差吸收营养物质的过程。是营养物质吸收的主要形式。 物质：有机、无机离子，糖类 方向：双向，可逆浓度进行 动力：代谢能 好氧 呼吸能厌氧 MO 化学能光能 光能,特点： 1、耗能 2、可逆浓度差进行 3、需要载体蛋白参与 4、对被运输物有高度的立体专一性要求
11、 5、被运输物质在转移的过程中不发生变化,Comparison of passive and active transport.,主动运输模式图,细胞膜,细胞膜外,细胞膜内,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,Na+-K+-ATP酶系统,Na+-K+-ATPase： 是存在于原生质膜上的一种重要离子通道蛋白 功能: 利用 ATP 能量将 Na+ “泵”出胞外,将 K+ “泵”入胞内。,作用步骤: 1.ATP酶(E)在细胞内与3个Na+结合, 消耗能量; 2.磷酸化ATP酶(E+)构象变化将Na+排出胞外,并与2个K+结合; 3. K+激发E+脱磷酸化恢复为E, 同时将K+运入细胞.,概念
12、：是特殊的主动运输，被运输物质在运输过程中发生了化学变化，其余特点与主动运输相同。物质：单、双糖与其衍生物，核苷、脂肪酸 位置：厌氧和兼性厌氧型细菌,4、基团转位 (Group translocation),1、在酶的作用下HPr被激活,2、在酶的作用下 P-HPr将磷酸转移给糖,基团转位 磷酸转移酶系统包括酶、酶和热稳定蛋白(HPr)。,第一步 少量HPr被磷酸烯醇丙酮酸（PEP）磷酸化,第二步 磷酸HPr将它的磷酰基传递给葡萄糖，同时将生成的6-磷酸葡萄糖释放到细胞内。,基团移位模式图,细胞膜外,细胞膜内,S,S,S,S,HPr,P,P,HPr,Enz1+PEP,丙酮酸,四种运输营养物质方
13、式的比较,概念：由人工配制、适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质。 特点：1、应具备六大营养要素2、比例适当（灭菌） 用途：促使微生物生长；积累代谢产物,第四节 培养基 (medium),一、培养基的配制原则,（一）组分应适合 MO 的营养特点（目的明确） （二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） （三）物理化学条件适宜（条件适宜） （四）根据培养目的选择原料及来源（经济节约）,（一）目的明确,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。按微生物类群不同，配置不同成分的培养基: 细菌: 牛肉膏蛋白胨培养基 LB 放线菌：高氏一号培养基 真菌： 查氏合成培养基 PDA 酵母菌：麦芽汁
14、,细菌培养基营养肉汤（nutrient broth)： 牛肉膏 3g； 水 1000ml；蛋白胨 5g ； pH 7.27.4 放线菌培养基高氏1号：可溶性淀粉 20g； KNO3 1g; K2HPO4 1gMgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO47H2O 0.5g水 1000ml; pH 7.27.4 霉菌培养基查氏（zapek)培养基：蔗糖 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O 0.5g;FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g;NaNO3 3g; pH 6.7 酵母菌培养基麦芽汁培养基,（二）营养协调,2、速效性氮（或碳）源与迟效性氮 （或碳）源
15、的比例 3、各种金属离子间的比例,碳源中的碳原子的mol数 氮源中所含的氮原子的mol数,1、C/N比值=,（三）条件适宜,（1）pH: 细 菌：7.0-8.0 霉 菌：4.0-5.8放线菌：7.5-8.5 酵母菌：3.8-6.0内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液。,（2）渗透压和aw,等渗：适宜微生物生长高渗：细胞发生质壁分离低渗：细胞吸水膨胀，至破裂,嗜盐微生物（Halophiles）：能在高盐环境（2.8-6.2M NaCl）生长的微生物常。,（3）氧化还原电势 (redox poyential),好氧微生
16、物：+0.3-+0.4V 厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长 兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵,（四）经济节约,应用目的：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,1.生态模拟 2.查阅文献 3.精心设计 4.实验比较,二、设计培养基的方法,高压蒸气灭菌一般培养基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min含糖培养基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min过滤灭菌分别灭菌间歇灭菌,培养基的灭菌,附图：过滤灭菌,器皿的灭菌及无菌室的消毒,器皿的灭菌：干热空气： 160，
17、2 小时 无菌室的消毒：紫外光化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）,三、培养基的类型及其应用,1、根据所培养微生物类群分 细菌培养基 放线菌培养基 霉菌培养基2、根据培养目的来分 种子培养基(seed culture medium）营养较丰富 发酵培养基(fermentation medium）原料应价廉易得 还应有利于下游的分离提取。,味精生产菌北京棒状杆菌AS1299的一级种子（用摇床培养） 培养基配方：,葡萄糖 3% 玉米浆 2.53.5% 尿素 0.30.5% K2HPO4 0.10.2% MgSO4 0.05%,二级种子（1200升发酵罐）培养基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他
18、成分相同。,3 按培养基成分 天然培养基(complex medium)：利用化学成分不清楚或不恒定的天然物质制成的培养基。 合成（组合）培养基(synthetic medium)：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。 半组合培养基(semi-defined medium)：在合成培养基的基础上添加些天然成份。,4 按物理状态来分 液体培养基(liquid medium)：不含凝固剂。 固体培养基(solid medium)：加入凝固剂（琼脂1.5-2) 。 半固体培养基(semi-solid medium)：加入0.2-0.7的琼脂。 常用来观察细菌运动的特征，以进行菌种鉴定和噬菌体效
19、价滴定等方面的实验工作。,5 按特殊用途划分 基础培养基(minimum medium):含有基本营养物质。 选择性培养基(selective medium)：根据某种特殊营养需要设计的培养基。 鉴别性培养基(differential medium)：鉴别不同类型微生物的培养基，加指示剂或化学药品。 加富培养基(enriched medium)：加入某些特殊的营养物。,伊红美兰乳糖培养基(Eosin Methylene blue),G+菌受抑制,G-菌,能发酵乳糖产酸,不发酵乳糖不产酸，菌落无色透明,产酸力强，菌落呈紫绿色金属光泽,产酸力弱，菌落棕色,Enterbacter Klebsiella Hafnia Sarrdia,Proteus Salmonella Shigella,E.coli,试样,EMB在鉴别各种肠道杆菌中的作用：,EMB(Eosin Methylene Blue),Figure 14. Left: Escherichia coli cells. Right: E. coli colonies on EMB Agar.,
