1、第二章：细胞周期的模式生物及分析方法,真核生物具有十分相似的细胞周期调控机制,单细胞的酵母：细胞分析 蛙的早期胚胎：生化分析 果蝇：遗传分析 哺乳动物的培养细胞：细胞功能分析,第一节 酵母,芽殖酵母 Saccharomyces Cerevisiae裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe,一、芽殖和裂殖酵母的生活周期,尽管同属于系统发生树的一个侧枝，但两个种类却只是远源相关。 它们在好几百万年之前就开始在进化上出现分叉，两者间的不相关性不亚于酵母与人类。 可以行单倍体生殖和两倍体生殖,芽殖酵母 Saccharomyces Cerevisiae,裂殖酵母 Schizosacc
2、haromyces pombe,特点：,快速增殖 较小并完全明确的基因组 能在单倍体状态下进行繁殖，染色体以单个拷贝或同源物在细胞中存在 容易制造突变来失活某个基因 容易删除特定基因 容易用已知突变来取代特定基因,二、 酵母中细胞周期调控的遗传分析,二、 酵母中细胞周期调控的遗传分析,生长迅速：每个周期大约为90分钟到2小时 。 易遗传操作：表型易鉴定，同源重组效率高，易于突变和敲除，可方便地研究基因功能，分析基因产物。 分裂易控基因组序列已经完成，基因组相对较小（芽殖酵母中大约1千五百万个碱基对，分布于16条染色体；裂殖酵母中大约1千五百万个碱基对，分布在3条染色体上），基本的细胞、遗传、代
3、谢的机制与高等生物类似。,4，条件性突变,改变环境条件控制酵母的生长、分裂 制作细胞分裂周期基因突变的细胞，只有在突变受制约的情况下才能繁殖：即突变的基因产物只有在特定的条件下才是没有功能的。 大部分突变体属温度敏感型，因而基因产物在低温（许可条件，通常指室温）下有功能，而把细胞移入高温(限制条件，通常指37)时则失活。,cdc16突变体：短的后期前纺锤体，染色体没有分离。当然出芽和芽体的生长不受影响 cdc15突变体：有丝分裂后期发生阻滞，染色体已分离，后期纺锤体拉长。胞质分裂没有完成,第二节 爪蟾 Xenopus Laevis,蛙的早期胚胎可用于简单细胞周期的生化鉴定,尺寸巨大：非洲蟾蜍的
4、受精卵，直径为1毫米，很容易注射一些测试药物，以检测它们对细胞周期进程的影响。 无细胞体系的构建：这些受精卵中还可以分离出较纯的细胞质，在试管中重建众多细胞周期事件。,早期胚胎细胞周期的试管重建,活化的蛙卵破碎，分离卵细胞质。 添加精子细胞核，精子染色体去压缩，并被包装在核膜内。 随后精子DNA发生复制，提取物能顺利进行有丝分裂，并将复制的精子染色体分离。,爪蟾囊胚前期细胞中存在自主性的细胞周期振荡或生物钟，即使去除细胞核而使细胞周期事件严重受损，该生物钟依然能按正常时序运转,第三节 黑腹果蝇 Drosophila melanogaster,世代周期为2周，在实验室控制条件下容易生长。细胞周期
5、调控系统的成分与特征尤其是多细胞动物特有的与人的极为相似。 果蝇的基因组含有约14,000个基因，大概是酵母的两倍，人细胞的一半。 外源基因也能够在特定的组织中或在诱导型启动子的控制下异位表达。 对经典遗传学来说，用果蝇能很容易地进行突变基因的筛选。,一、简化的果蝇早期胚胎细胞周期,受精后，进行一系列快速、同步的分裂，无间隔期，每次分裂不超过10分钟。 无胞质分裂：合胞体 13次分裂后，行胞质分裂：细胞化（细胞囊胚层）。 13次分裂后，合子基因的表达才变得明显。,二、间期在胚胎发生后期才出现,第14到16个周期产生G2期，其长度在发育胚胎的不同区域不一。 第14到16次有丝分裂是不同步的，但取
6、而代之的是出现程序性的时空模式，与此阶段发生的复杂形态发生运动相协调 第一个G1期的出现是在第17个周期。胚胎的大部分细胞停滞在这一时间点并最终进入一个特化的核内复制循环，这个过程中它们经过多轮的DNA复制而不发生有丝分裂。 在有些胚胎中，G1期停滞的上皮细胞程序性地进入不同的命运：成为成虫细胞，能够发育成成体果蝇的主要构造。,第一个G1期的出现是在第17个周期。胚胎的大部分细胞停滞在这一时间点并最终进入一个特化的核内复制循环，这个过程中它们经过多轮的DNA复制而不发生有丝分裂。 在有些胚胎中，G1期停滞的上皮细胞程序性地进入不同的命运：成为成虫细胞，能够发育成成体果蝇的主要构造。,二、间期在
7、胚胎发生后期才出现,三、成体果蝇结构发育自成虫细胞,每个成虫盘由胚胎的一群10-50个停滞在G1期的成虫细胞构成。 当幼虫开始进食时，这些细胞开始生长和分裂直到成虫盘包含有几千个细胞，能够在变态时进一步分化为成体构造。,第四节 哺乳动物的细胞周期分析,与人类细胞直接相关 哺乳动物细胞对于研究复杂的控制细胞分裂速率的信号网络尤其重要。 我们只有在哺乳动物细胞中，才能观察并详细分析与人最相关的分子组分和信号系统。为了对抗癌症及其他细胞增殖失控相关疾病，了解这些系统是设计合理的治疗方案非常关键的步骤。,原代细胞在培养中有着有限的增殖生活周期：例如，人的原代细胞，体外培养到25到50次分裂后停止分裂，
8、很多啮齿目细胞类型甚至在更少的分裂次数后就停止分裂这种细胞周期停滞称为复制老化。,一、哺乳动物细胞的永生化和转化,细胞衰老的两个普遍机制：,首先，很多细胞类型会将细胞周期逐步停滞，以应对培养皿中的非生理条件。在这样的环境中，细胞缺乏正常的细胞-细胞接触，而且通常一直处于异常水平的血清调节因子中。 其次，某些细胞的老化，由端粒结构变化引起。端粒逐步降解，直到DNA损伤反应系统察觉到这种损伤，触发细胞周期停滞。,当细胞在体外培养环境中生长很长一段时间，群体中的细胞会积聚自发的突变以防止衰老，因而产生了永生化的细胞系。 转化的细胞系积累了大量的遗传损伤，不仅导致了永生化，也破坏了那些正常限制细胞增殖
9、速率的调控系统。当将它们注射入小鼠体内时，能形成肿瘤。这些细胞用于研究正常的细胞增殖调控并不理想，但是对于直接分析癌症表型下所存在的分子缺陷却非常有用。,二、研究哺乳动物细胞蛋白功能的方法,用哺乳动物细胞作为实验系统的主要缺点在于，缺乏快速特异的方法，在完整无损伤的细胞中来阻断基因与蛋白的功能。 注射抗体 优势负性 RNA干扰 敲除目的基因 CALI(chromophore assitent laser inactivation),Photo-activation and CALI: The perturbation of molecular function within single ce
10、lls,Fluorescence resonance energy transfer (FRET): assessing intramolecular association in vivo,第五节 细胞周期分析方法,1，形态观察 芽殖酵母和裂殖酵母的细胞周期定位可相对通过芽体的大小和细胞的长度来判定。 哺乳动物细胞，在细胞周期的大部分时间都比较平坦，附着于培养皿底部，M期的细胞附着性降低，细胞变圆，折射率增高。,荧光标记：周期特异蛋白质、DNA,活体细胞进行荧光标记,Li et al, J Cell Science,1999,FACS：DNA含量,细胞同步化,1，有丝分裂选择法：M期细胞与培
11、养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%） 。 2，细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。 优点：可用于任何悬浮培养的细胞。 缺点：同步化程度较低。,1）有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。 优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%） 。 2）细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。 优点：可用于任何悬浮培养的细胞。 缺点：同步化程度较低。,3，DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TdR双阻断法： 在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TdR。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TdR，释放时间大于TS时，再次加入过量TdR。,G1,S,G2,M,G1/S,4，中期阻断法 用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。 5，FACS分选,
