1、ELISA-2 （乙肝两对半的检测）,临床免疫学教研室 邓念华,【目的要求】,1.掌握乙肝两对半的检测原理及操作过程； 2.熟悉影响乙肝两对半检测的因素； 3.进一步熟悉酶标仪及洗板机使用； 4.了解乙肝两对半的临床意义。,【原理】,【器材】,SM-3型自动化酶免分析仪 ZMX-988B型全自动酶标洗板机 微量加样器 吸头等,【试剂】,HBsAgELISA试剂盒 HBsAbELISA试剂盒 HBeAgELISA试剂盒 HBeAbELISA试剂盒 HbcAbELISA试剂盒,【标本】,待测血清,【操作步骤】,准备：试剂盒各组份在37平衡30min； 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；
2、加样品：每孔加入待测样品75ul/孔，同时设置阳性对照、阴性对照，空白对照（不加样品），轻轻振荡混匀； 孵育：贴上封膜，37反应60min; 加酶结合物：每孔加入50ul/孔（空白对照不加），震荡10秒钟；,表面抗原检测(双抗体夹心法),孵育：贴上封膜，37 反应30min; 洗板：洗板机5次，最后一次尽量扣干； 显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应30min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时） 终止：加终止液50ul； 判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。,结果判断及解释 COV=2.1OD阴性对照 阳性：OD样品
3、COV 阴性：OD样品COV 检测有效性 OD阴性对照0.10， OD阳性对照1.0 OD空白对照0.04（双波长检测）,准备：试剂盒各组份在37平衡30min； 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 加样品：每孔加50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）； 加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）； 孵育：贴上封膜，37 反应30min；,表面抗体检测(夹心法),洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔； 显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)； （注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）
4、 终止：加终止液50ul； 判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（ OD阴性对照低于0.05按0.05计算） 阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性 OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0 OD空白对照0.015（双波长检测）,准备：试剂盒各组份在37平衡30min； 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）； 加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）； 孵育：贴上封膜，37 反应30min；,e抗原检测(夹心法),洗板：洗板机5次，
5、每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔； 显色：先加显色液A50ul，再加入显色液B50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)； （注：显色从加入第一滴显色液B开始计时） 终止：加终止液50ul； 判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。,结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（ OD阴性对照低于0.05按0.05计算） 阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性 OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0 OD空白对照0.015（双波长检测）,e抗体检测(竞争抑制法),准备：试剂盒各组份在37平衡30min； 配洗涤液：用纯化水按1:25
6、将浓缩洗液稀释； 加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）； 加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）； 孵育：贴上封膜，37 反应30min；,显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)； （注：显色从加入第一滴显色液B开始计时） 终止：加终止液50ul； 判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=0.5 （OD阳性对照+OD阴性对照） 阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性 OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05 OD空白对照0.015（双波长检测）,
7、c抗体检测(竞争抑制法),准备：试剂盒各组份在37平衡30min； 配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释； 加样品：每孔加50ul（1:30稀释样本），同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）； 加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；,孵育：贴上封膜，37 反应30min； 显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)； （注：显色从加入第一滴显色液B开始计时） 终止：加终止液50ul； 判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=0.5 （OD阳性对照+OD阴性对照） 阳性：OD样品CO
8、V 阴性：OD样品COV 检测有效性 OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05 OD空白对照0.015（双波长检测）,1.不同品种及批号试剂组份请勿混用； 2.试剂从2-8条件下取出，先在室温平衡1h； 3.最好用微量移液器加各种组份； 4.每次手工加样，应更换吸头； 5.加样时尽量避免反应微孔中产生气泡； 6.封板膜不能重复使用；,【注意事项】,7.洗液如有结晶形成建议放置37充分溶解，再稀释； 8.洗板：(洗板机) 1)每次使用前、后用蒸馏水或去离子水冲洗，以防止管路堵塞和腐蚀； 2)加液量不能过多溢出，但又能充满整个反应微板(350ul); 3)一般洗板次数不应少于5次； 4)最好采用有底部冲洗和两点冲洗的程序。,
