1、8.3.3 组蛋白的乙酰化及去乙酰化,组蛋白乙酰化是一可逆的动态过程。组蛋白乙酰基转移酶(HAT) 将乙酰辅酶A 乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端上特定赖氨酸残基的2氨基基团。这些赖氨酸的乙酰化导致电荷的中和以及DNA 与组蛋白的分离,使核小体DNA 易于接近转录因子。在此种情况下,其他因子就可乘虚而入结合于DNA 上。1. 组蛋白的基本组成,2X (H2A, H2B, H3, H4),2. 核心组蛋白的乙酰化与去乙酰化乙酰化：组蛋白乙酰基转移酶 去乙酰化：组蛋白去乙酰化酶,3. 组蛋白乙酰基转移酶（HAT）目前已发现的HAT有两类： 一类与转录有关 另一类与核小体组装以 及染色质的结构有关
2、。,HAT并不是染色质结合蛋白，但可以通过与其他蛋白相互作用来影响染色质的结构。,组蛋白的乙酰化能中和赖氨酸的正电荷，C=O具有一定的负电，能够增加与DNA的斥力，使得DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。,4. 组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶负责去除组蛋白上的乙酰基团。目前研究比较深入的是人类中的HDAC1和酵母中的Rpd3。它们都形成很大的复合体发挥作用。,Rpd3能特异性去除组蛋白上的乙酰基团，使核小体相互靠近，并在转录共抑制子Sin3及R的协同作用下，抑制基因转录。,5. 组蛋白的乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响,组蛋白乙酰化的状态与基因表达有关。组蛋白N端“尾巴”上赖氨酸残基
3、的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活性。 相反，组蛋白去乙酰化与基因活性的阻遏有关。 组蛋白乙酰基转移酶和去乙酰化酶只能有选择地影响一部分基因的转录。,Model for methylation-dependent gene silencing. Acetylation of the histones causes an open chromatin configuration that is associated with transcriptional activity. Methyla
4、ted cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, converting the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery.,DNA甲基化诱导了组蛋白的去乙酰化作用，使靶基因转录受抑制。,8.3.4 组蛋
5、白甲基化对于真核基因表达的调控,组蛋白甲基化的功能,各种组蛋白甲基化修饰在染色体上的分布以及功能不尽相同,非组成型异染色质化 多发生在不同生长发育时期一些需要被沉默的基因区域。 雌性的随机失活的一条X染色体。,组成型异染色质化 通常发生在染色质中心粒、端粒区域。保持中心粒、端粒的异染色质化。,表观修饰的遗传 通过已经存在的标记招募相应甲基转移酶到染色质附近。,母三色猫的斑驳毛色是X去活化的表现，“黑色皮毛”与“橙色皮毛”的等位基因位于不同的X染色体上。由于x染色体去活化的对象是随机选择，因此不同部位，会依保留活性之染色体的不同，而有不同的毛色。 玳瑁猫,常表达染色质 比异染色质区有更宽松的修饰
6、环境。不同甲基转移酶蛋白和不同磷酸化状态的RNA聚合酶II相互作用，导致两种组蛋白甲基化在基因区的不同分布方式。,启动子解脱 转录区域,修饰的整合作用 多种组蛋白修饰作用不是彼此孤立存在的，它们往往参与同一个基因的表达调控。,2. 组蛋白甲基转移酶,不同的HMT催化不同的底物，酶催化中心的一些关键氨基酸所构成的不同的空间位阻决定该酶能够添加多少个甲基。,3. 组蛋白去甲基化酶,可以脱去组蛋白甲基化的一类酶，主要有LSD1和JmjC家族去甲基化酶两类。在FAD的参与下, LSD1在体外和体内都可以特异去掉二甲基和一甲基修饰但LSD1去甲基的活性受到底物的限制, 不能去掉赖氨酸的三甲基修饰。同一个
7、去甲基化酶可以行使转录激活和转录抑制两种相反的功能，视与其合作的因子而定。JmjC家族去甲基化酶需要铁离子和a-酮戊二酸参与反应，可以去掉赖氨酸的三甲基化修饰。许多赖氨酸去甲基化酶中的jumonji结构域是酶的催化活性结构域。,RNA干扰及其应用,最早在矮牵牛花中发现此现象 1990，Jorgensen 在矮牵牛花中过表达花青素色素基因 (anthrocyanin pigment gene)以加深花的颜色。 Caused the loss of pigment.,RNAi的发现,Called co-suppression because suppressed expression of bot
8、h endogenous gene and transgene.,Two mechanisms can explain this transgene-mediated gene silencingTranscriptional gene silencingPost Transcriptional Gene Silencing (PTGS) mRNA is made, but then degraded,RNAi的发现,RNAi的发现,1995年，Kemphues KJ, Guo S 等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计：反义RNA 特异性地阻断par
9、-1基因的表达；正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 Cell. 1995, 81 (4): 611-620,RNAi的提出,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。表格 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由
10、于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。,In 1998 Andy Fire and Craig Mello showed that injections of double stranded RNA was more effective than single stranded RNA in generating mutant phenotypes.,RNAi的提出,RNAi的含义,RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指由双链RNA诱发的基因沉默现象。 其机制是通过阻碍
11、特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默 。 与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚至于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被
12、逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,1、RNAi 机制,体外实验结果的提示,体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片
13、段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。,short-interfering RNA,通过一类较稳定的中间介质实现的。植物：双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。 果蝇：长度为2123nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称为小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）。,siRNAs,Long dsRNA,在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成2123nt及3端
14、突出的小分子RNA片断，即siRNA。,随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。,与RNAi有关的蛋白因子,迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。 果蝇RISC中存在Argonaute2(AGO2)因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失
15、，即AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶（RNA helicase）也被鉴定为参与RNAi机制的因子。 秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的。 在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在
16、着微妙差异。,RNAi作用的简单模型,当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-
17、2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。,RNAi研究的一般技术路线,2、siRNA 的设计,何为siRNAs,越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。,一般设计原则,（1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC
18、含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs）。这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 （2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST （3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。,负对照,一个完整的siRNA实验应该有负
19、对照。 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。,制备siRNA5种不同方法的比较,制备siRNA5种不同方法的比较（续）,3. RNAi的效果分析,可从mRNA和蛋白质两方面进行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。 蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。,4、RNAi技术的应用,（1）在功能基因组中的应用,在功能基因组研究中，需要对特
20、定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。 由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干涉，使目的基因沉默，从而进一步研究目的基因的功能，这种技术即为RNAi技术。 根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi技术。,编码区RNAi技术,自1998年在线虫中发现RNAi现象以来，以基因编码区为靶序列的编码区RNAi技术已用于
21、线虫功能基因组的研究。 最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达，产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。 这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成dsRNA的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。 为弥补早期RNAi技术的上述不足，Tavernarakis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。 热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默。,编码
22、区RNAi技术,这种改进的RNAi技术与传统的RNAi技术相比，具有明显的优点： 首先转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析； 其次dsRNA可以被诱导产生，RNAi能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能； 另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。 Kennerdell J. R.和CarthewR. W.用GAL4/UAS系统控制dsRNA在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控制RNAi的发生。,编码区RNAi技术,随着应用RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展，研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了
23、探索。 加州理工大学的Chuang C. F.和Megerowitz E. M.使用此技术研究了拟南芥的AG, CLV3, AP1, PAN四个开花相关基因。 结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变体，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。RNA原位杂交表明，RNAi突变体的目的mRNA显著降低。 该结果说明RNAi技术亦可以成为植物功能基因组研究中的有力工具。,启动子区RNAi技术,M. F. Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23核苷酸长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。 由于多基因
24、家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。 这样综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。 RNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。,启动子区RNAi技术,与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAi技术具有明显的优点，它比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变。 而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可
25、以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与T-DNA技术造成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。 相对于基因敲除技术(knockout)，RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制(knockdown)技术，是研究特定基因功能的有效方法。某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物细胞基因组学功能研究中将起重要作用。 作为一种新的、强有力的研究工具，RNAi在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题之一。,（2）在基因治疗中的应用,治疗HIV 感染 由于RNAi是机体中古
26、老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。 针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV 1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA，Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等针对HIV病毒gag基因设计的siRNA，其基本策略都是选择HIV病毒或宿主细胞基因为靶点。,治疗HIV 感染,然而，RNAi治疗HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决： 、作用靶点的选择，siRNA对序列要求非常严格，1个碱基的错配，将大大降低siRNA基因表达抑制作用。如果HIV逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核
27、苷酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为siRNA的设计和合成增加了难度。 、如何有效导入siRNA。DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。 、增强siRNA在细胞中的稳定性。为了防止细胞内RNA酶对siRNA的降解，可以用DNA质粒和病毒载体将siRNA以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。,治疗肝炎病毒感染,Jude Lieberman等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。 他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够
28、启动细胞的自杀程序。 据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。 Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默” FAs基因的siRNA，发现有90的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40在天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。,治疗肝炎病毒感染,McCaffre A及其导师Kay M结果则证明RNAi可以直接治疗肝炎病毒。 他们首先将HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中，模拟HBV感染，然后合成靶向HBV基
29、因组不同部分的2种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对照组相比减少了92%。 治疗组小鼠没有发现严重的副作用。 但Kay指出，这种运送siRNA方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。 对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。,治疗肿瘤,多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA 。 Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因k ras (v12)的表达。 对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。 Scher 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr ab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。 Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取得了成功。 因此基于 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。,
