1、第二章 基本操作及常规方法一、常规仪器与器具 1. 器具: 一般原则 1) 除了不能灭菌的器具外, 必须洗净, 蒸馏水洗, 高压灭菌;2) 如是重复使用的器具, 必须用完马上浸泡在水或洗液中, 不能干燥。3) 为了减少交叉污染, 在经济条件允许下, 使用一次性器具。,试管、离心管及Tibe头: 需要注意灭菌性能、离心速度、有机溶液 (氯仿等) 的使用。玻璃移液器、玻璃瓶: 璃移液器用完马上浸泡, 把用于RNA 和 DNA的分开 玻璃瓶洗净, 和溶液一起灭菌。 注意玻璃瓶的颜色。细菌和细胞培养器具: 除一次性灭菌好了的器具直接使用外, 其他都要洗净, 高压灭菌。,2. 离心机: 可分为台式和落地
2、式离心机, 常温和低温离心机。 使用时需要注意离心机的速度、平衡、温度及离心管的摆放。3. 电子秤: 使用时需要注意秤量范围, 轻放和它的稳定性。4. 水浴锅: 使用时需要注意通宵使用防水干。,二、试剂及溶液一般原则: 1) 除了不能灭菌的溶液外, 包括超纯水或重蒸水, 必 须高压灭菌;2) 试剂类用分析纯以上的级别;3) 配试剂的水最好是去离子的重蒸水, 直接用的水最 好是超纯水;4) 配制的缓冲液则离子水, 甚至蒸溜水足够；5) 配制高浓度贮存液 (stock solution), 取出少量使用。 重要试剂, 必要时可放在-20 oC。 常用贮存液参考。,三、常规方法1. 电泳主要用于 D
3、NA 和 RNA的分离纯化、鉴定等。 分离 的基本原理是根据 DNA 和 RNA的分子大小、电荷、形态，载体主要为琼脂糖凝胶 (agarose) 及聚丙烯酰胺 (PAGE)。,1) 琼脂糖凝胶制作取一定量的琼脂糖 + 1 电泳缓冲液, 加热至沸腾, 摇晃溶解, 放置至50-60 oC, 再加溴乙啶( 10mg/ml) 5 l/ 100ml溶液, 注入凝胶槽, 凝胶凝固后即可使用。一般用的凝胶浓度是 0.8-1.2 %。不同浓度的凝胶用于分离不同大小分子的核酸, 如下所以示：0.3% 0.6% 0.7 % 0.9 % 1.2% 1.5% 2.0%kb 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7
4、 0.4-6 0.2-4 0.1-3,2) 电压: 一般为50-100 V； 3) 电泳: 样品10 l + 2 l 6 色素液 (溴酚兰)； 4) 检测: 加DNA 标准分子量, 紫外灯下观察, 拍照； 5) 电泳缓冲液：1 TBE or TAE。,DNA片段的回收1) 低熔点凝胶法: 切出DNA片段 + TE缓冲液70 oC , 10min, 三次剧烈震荡 加预热的酚等量, 抽提2-3次乙醇沉淀。,2) DEAE paper 法: 用普通琼脂糖凝胶, 目的条带和其它DNA片段分开, 在紫外灯下将适当大小的DEAE paper插入目的条带的前面, 继续电泳数分钟, 取出DEAE paper放
5、入试管, TE缓冲液洗 3次 加1 M NaCl/TE缓冲液 65 oC , 30min 回收溶液再加1 M NaCl/TE缓冲液, 65 oC , 15min 回收溶液, 合并乙醇沉淀.其它的DNA片段的回收方法还有电泳法、破碎法、试剂盒等, 各有优缺点。,3. 酚抽提在纯化DNA时, 除去蛋白、脂肪等杂质时用酚抽提。 基本操作是: 酚抽提酚/氯仿抽提氯仿抽提。 必要的场合, 为了除去酚/氯仿等有机物, 最后可加乙醚。1) 酚制备: 国产酚一般需要重蒸。常温下酚为固体, 用65 oC小心加热, 溶解, 再加0.05-0.1%的8-羟基奎林, 防氧化。然后加等量的1M Tris-HCl (pH
6、 8), 混匀, 4 oC静置4-6 h, 再加1M Tris-HCl (pH 8), 重复共3次。 最后一次上清不弃, 防氧化。 4 oC下可放 3-4 个月。,2) 酚抽提: 加入的酚溶液和DNA溶液等量 剧烈震荡, 室温, 5000-10.000 rpm, 3-10 min 取上清 酚或酚/氯仿/异戊醇 (酚: 氯仿/异戊醇= 1:1; 氯仿/异戊醇= 24 : 1 )重复数次, 然后乙醇沉淀,4. 浓缩与透析 1) 浓缩 核酸(DNA和RNA)溶液的浓缩、脱盐等场合, 最常用的方法是乙醇沉淀。 通常是: DNA和RNA 溶液 + 1/10 体积的 3 M NaOAc(pH4.8 or
7、5.2) + 2.5 100% EtOH，混匀 -20oC, 30 min以上 4oC, 10000-16000 rpm, 10 min 70% EtOH洗, 干燥,在核酸(DNA和RNA)溶液体积大的情况下, 也可以加等量的异丙醇混匀, 室温下放20 min, 后面的步骤同上。在不能沉淀的场合, 可以用正丁醇浓缩, 丁醇可以使核酸 (DNA和RNA) 溶液中的水在水相和有机相之间再分配。,通常是: DNA和RNA 溶液 + 等量正丁醇 混匀, 5000-8000 rpm, 5-10 min, 取上层, 重复数次。由于丁醇浓缩不能除盐, 浓缩后盐浓度大大提高, 必须用透析等方法除盐。除去丁醇也
8、可以用乙醚。,2) 透析由于核酸(DNA和RNA)溶液不能沉淀浓缩, 而盐浓度过高, 可用透析等方法除盐。注意: 往往透析后核酸(DNA和RNA)溶液过稀, 需要再次浓缩。,透析袋: 用50 mM EDTA, 100oC 10 min 数次蒸馏水洗净, 浸泡在蒸馏水中, 4 oC , 3个月没有问题. 注意透析袋绝对不能干燥。 将核酸溶液装入透析袋, 夹子夹好 500-1000 TE 缓冲液, 4 oC 重复数次，直到满意,5. 核酸的定量法光学方法 核酸分子中有5种碱基:A、C、T、G、U, 在OD260的紫外线处有极强的吸收, 此定量的依据是: OD260 1 = 50 g/ ml 双链D
9、NA= 40 g/ ml 单链DNA 或RNA= 20 g/ ml 单链寡核苷酸,2) 电泳检测在无法光学方法检测或核酸 (DNA和RNA) 溶液受到污染, 含有其它可吸收紫外线的物质, 这时可用电泳方法。琼脂糖凝胶中含有溴乙啶, 核酸电泳时和溴乙啶结合, 在紫外灯下发出橙色荧光。 电泳时同时以已知的标准样品作为对照, 即可测出样品的核酸含量。,3) 液滴法核酸(DNA和RNA)样品很少时测定极微量核酸的方法取封口膜(parafilm)放在紫外灯上, 核酸样品 + 等量的 溴乙啶溶液 (1-2g/ml)。同时以已知量的核酸作为对照, 观察拍照。,6. 限制性内切酶的使用所谓限制性内切酶, 就是
10、识别特定的碱基序列, 切断双链核酸的酶. 以区别聚合酶、连接酶、外切酶等。,限制性内切酶,已经发现和鉴定了200多种,EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 粘性末端 T4连接酶,用法：DNA 溶液 8.5 l 10 缓冲液 1 l 限制性内切酶 ( 5 ) 0.5 l 10 l 限制性内切酶单位的定义: 1 小时切断1 g phage DNA的酶量为1 。注意事项: 缓冲液浓度、酶切温度、DNA浓度、反应体积等。,其他: 1) 酶用前稀释； 2) 延长反应时间也未必好(酶贵, 用量少, 时间长) 3) 用酶过多未必好, 改变了反应条件； 4) 最好戴手套操作； 5) -20
11、oC冰箱取出限制性内切酶时, 应放在冰上, 尽快返回； 6) 两种酶同时切时, 可以先低盐酶, 后高盐酶, 或先切一个, 再切第二个； 7) DNA切不断: 部分消化，则稀释, 或改变酶量 反应时间等。完全切不动, DNA重新纯化, 检查酶活性等。,7. 大肠杆菌(E. coli)操作 1) 基因型的识别一般3个意大利小写字母表示变异基因, 必要时4个字母. 右上 +: 野生型; -: 突变型; : 缺失; : 融合。JM105: supE end A (lac-proAB)要知道细菌的营养要求、代谢变异、碳源利用、抗药性等其他事项。2) 培养基SOB, SOC, LB, YT, NZY等, 参考, 注意抗生素的添加。,3) 培养划线培养; 注入培养; 涂板培养; 液体培养4) 保存 平板保存: 划线, 4 oC, 2周； 菌液保存: 4 oC, 1周； 甘油保存: -70 oC，长期保存。,重组DNA操作步骤：,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成重组DNA分子 （3）转化受体细胞 （4）筛选和鉴定 （5）对细胞或生物体通过培养，获得外源基因表达的的产物,
