1、山东省医学科学院硕士学位论文常见致病真菌性角膜炎小鼠模型的建立姓名：王殿强申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：谢立信20060401学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。学位论文知识产权权属声明本人在导师指导F所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或
2、成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。1论文作者签名：二兰啦鲫一业立革垒!兰2006胼堙研究乍毕竹沦立常见致病真菌性角膜炎小鼠模型的建立山东省眼科研究所研究生：王殿强导师：谢立信教授【摘要J目的真菌性角膜炎是一种严垂的敏直性跟瘸，发病宰呈明显上升趋势，占感染性眼病的比例逐年增大，近年我国多地区统计显示真苗性角膜炎已跃居感染性角膜疾病的首位而临床上对真菌性角膜炎的处理颇为棘手，缺乏低毒、特异、有效的抗真菌药物，部分患者在药物治疗期间病情加重，即便手术治疗仍有少数患者最终丧失眼球，因此，近年来i幺病已引起眼科医生的关注。探索疾病治疗方法首先是进行基础研究，而进行基础研究的基本途径就是建立杯准有效
3、的动物模型，但是目前报道的多种方法存在缺少统一标准、感染率低、可重复性不高及依赖糖皮质激素等缺点因此本研究探索一种新的方法：改良角膜表层镜法，在不应用糖皮质激素和免疫抑制剂的情况下，建立常见致病真菌性角膜炎小鼠模型，以便为进一步进行基础研究尤其是免疫学和分子遗传学发病机制做准备，同时观察菌丝在小鼠角膜基质内的生长方式等特点。方法选取3种临床常见的致病真菌：茄病镰刀菌、烟曲霉菌、白色念珠菌，近交系BALBc小鼠，应用改良的角膜表层镜法，即刮除角膜上皮，大鼠角膜片覆盖其上，二者层问注入菌液，缝合眼睑。按菌液浓度和闭台跟睑时间不同分组对比研究，拆除眼脸缝线后进行裂隙灯检查，临床评分，刮片、组织病理学
4、检查及角膜组织定量培养筛选最佳方法结果 (1)白色念珠菌组：菌液浓度1x1旷CFDm1闭合眼腧49h，小鼠角膜感染率100，角膜溃疡重持续时间长(8天)，PAS染色见大量菌丝，菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势，浸澜角膜深基质层，甚至穿透角膜进入前房，角膜易穿孔，前房炎症反应重。真菌培养阳性，定量培养角膜内真菌数量随时问推移逐渐减少(2)烟曲霉菌组：菌液浓度l10SCFUml，闭合眼睑72h，小鼠角膜感染率833，但轻重不等，持续时阃长短不一(4一S天)，且发现溃疡呈全板层剥离现象，角膜缘新生血管增生早且迅速，溃疡自愈倾向明显，PAS染色见菌丝浸润角膜全层，生长方式总体上呈垂直生长趋势，真菌培养
5、阳性。(3)茄病镶刀菌组：菌液浓度ixl0SCFI 7佃J，闭合跟腧72h，小鼠角膜感染率917，均为重度感染，持续时问长(8天)，PAS染色见菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势，且易穿透角膜进入前房，甚至穿透晶体囊膜浸润晶体皮质。角膜组织定量培养真菌数量逐渐减织结构、宿主的防御能力及其与真菌毒力的相互抑制剂情况下，改良角膜表层镜法可以成功诱导白色念珠菌和茄病镶刀菌感染BALBc小鼠角膜炎，可以用于真菌性角膜炎发病机理兕其免疫学及分子尘物学等机制的研究；烟曲霉菌致BALBc小鼠角膜感染窜十H对较低，自愈较迅速，可第2奥2006解倾l l!If究乍毕廿沦殳以扩大样本增加感染数麓用于早期发病机制研究
6、。(2)三种真菌菌丝在BALBe小鼠角膜摹质内，上长方式总体上均鬯垂直尘长趋势。(3)与以往真苗性角膜炎兔模型研究对比发现，同一菌株005)，接种第8天比较差异无统计学意义(t=O7818。PO05)。各组感染率及临床评分见表3a，3b。(二)角膜溃疡刮片B、D组接种第2、4天溃疡刮片可查见菌丝(图11)，刮片组织真菌培养阳性，浸润轻者未查见菌丝c、E组接种第3、4、5天均可查见菌丝，真菌培养阳性，溃疡旱板层剥脱后未查见菌丝，各组细菌培养均阴性。(三)组织病理学检查B、C、D、E组接种第4天PAS染色均见菌丝(图12a)，接种第8天未查见菌丝。菌丝浸润角膜全层，基质内菌丝呈较耔l短透明管状或棒
7、状，多为有隅菌丝，成簇分布，后弹力层前较密集，头端膨大呈串珠状，少鼍穿透后弹力层进入自口虏，第12贝2006届颂士研究生毕业论文角膜基质内菌丝生长方式总体上呈垂直生长趋势HE染色角膜及前房大量炎症细胞浸润(图12b)，前房积脓明显，菌丝集中处(角膜溃疡灶)炎症细胞较少，溃疡周围炎症细胞密集，随时间延长炎症细胞数量逐渐减少表3盘烟曲霉菌各组感染率及临床评分表(四)角膜组织匀浆定量培养B组接种第3天真菌培养阳性，C、D、E组接种第3、5天真菌培养阳性(图13)，第8天真菌培养均阴性，细菌培养均阴性。各组培养真菌菌落数见表4。第13页2006厢硕I。研究个毕竹论史表4角膜组织定带培养烟fl霉菌荫落数
8、第lll部分茄病镰刀菌()实验分组随机将42只小鼠分成4组，右眼为实验眼。A组：6只，对照组，生理盐水，闭合眼喻72小时B组：12只，标准株，10SCFUm|，闭合眼腧48小时C组：12只，杯准株，108CFUml，闭合眼腧72小时D组：12只，临床株，10ScFUml，闭合眼睑48小时二，观察结果(一)裂隙灯观察及临床评分A组(对照组)角膜上皮愈合，无明显水肿和混浊，角膜缘无新生血管生长，虹膜纹理清晰。B组感染率667(812)，角膜感染轻重不等，轻者为浅表浸润，虹膜及瞳孔隐约可见，重者局部深基质浸润，可见内皮斑，溃疡周围可见伪足，表面灰白色稀薄苔被覆盖，45天时溃疡最重，凹凸不平，局部增生
9、明显，同时角膜缘新生血管长入，轻者l周左右溃疡逐渐修复。c组感染率9179(1112)，重度感染，角膜溃疡重(图14)，呈黄白色或灰黄色，边界不清，凹凸不平，表面黄白色苔被附着，局部增生突起明显，溃疡明显处变薄，未见穿孔，略轻者局部可见内皮斑，前房积脓，隐见虹膜，大部前房情况不见，接种第46天溃疡加重明显，角膜迸一步变薄，表面稀薄黄白色苔被附着，1只穿孔(8-3)，轻者l周左右隧新生血管长入溃疡开始修复(图15)。D组感染率759(912)，接种第2天角膜感染轻重不一，随时fBj推移溃疡加重明显轻度浸润者逐渐形成明显溃疡，45天最重，同时新生血管长入，8天溃疡丌始修复。B与C组接种第3天临床评
10、分比较差异有统计学意义(t=30619，P005)，C组接种第3天与第3天临床评分比较差异有统计学意义(t=49365，P005)。各组感染率及临床评分见表5a，5b。(二)角膜溃疡刮片B组接种后第2、3天溃疡明显者可查见蒲丝，溃疡刮取物培养真菌和细菌均为阴性，D组于接种第2、3、4天查见菌丝，第2天真菌培养阳性，细菌阴性。钨14虹2006届硕士研究生毕业论文C组于接种第3、5、7天均查见菌丝(图16)，真菌培养均阳性，细菌培养阴性。表5a茄病镰刀菌各组感染率及临床评分表(三)组织病理学检查B组接种第4天PAS染色见角膜基质内少量菌丝，HE染色见基质及前房大量炎症细胞浸润C组接种第4天PAS染
11、色见角膜全层大量菌丝(图17a)，部分穿透角膜进入前房，甚至穿透晶体囊膜进入晶体皮质内(图17“o)，角膜基质及进入眼内菌丝形态无明显差别，多为有隔菌丝，均较长、直，分枝少，基质内菌丝总体上呈垂直生长趋势；第8天基质内仅见少量菌丝(图17c)。HE染色(图17d)角膜基质及前房内见大量炎症细胞浸润，包围在菌丝周围，角膜溃疡周边大量炎症细胞，8天时角膜周边新生血管生长(图17e)，晶体囊膜水肿增厚，周围炎症细胞浸润，重者晶体皮质溶解。D组接种第4天PAS染色见稀疏菌丝散第15页2)06刷硕I埘f究牛牛廿论文在分靠于角膜基质及前房内，部分穿透晶体鬟膜，HE染色角膜苍质及前房炎射；细胞枝涧。集中于葫
12、丝周蹋，角膜明显变薄。(四)角膜组织匀浆定量培养B组接种后第3天真菌培养阳性，第5天未见真菌生长。C组3、5、8天真菌培养均阳性(图18)，D组3、5天真菌培养阳性，8天未见真菌生长，细菌培养均阴性如表6示。表6角膜组织定量培养茄病镰刀菌菌落数(CFU)讨 论一，人类疾病动物模型的重要性和设计原受1j【232-41人类疾病动物模型(anilal model ofhuman disease)是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料人类疾病的发生和发展是十分复杂的，把人作为实验对象来推动生命科学的发展是有局限性的，许多实验也不可能在人体上进行动物模型可以拟补这些不足。目前，
13、动物模型已成为现代医学认识生命科学客观规律的主要工具，有助于研究者更深刻的认识疾病的发生，发展规律和采取更有效的防治措篪。建立有效的动物模型一般应遵循以下原则：相似性，重复性、可靠性、适用性和可控性、易行性和经济性建立有效的真菌性角膜炎动物模型，是进行真菌性角膜炎基础研究，探索发病机理，寻找有效治疗靶点的关键一步。但是，在眼部真菌病的研究中，大多数动物郡对常见致病真菌表现出抗病性，加上真菌种类繁多，本身复杂生活周期，因此建立有效的真菌性角膜炎动物模型一直是研究的热点和难点。二、建立真菌性角膜炎动物模型的方法(一)目前报道的方法及存在的问题目莳国内外报道的真菌性角膜炎动物模型所采用的方法包括角膜
14、基质注射法I悼J61，针蒯划痕法lllj及角膜接触镜法JI 7l等，选取的动物主要足兔，大鼠及小鼠，研究菌种主要集中在发达国家常见的白色念珠菌，但是接种苗液浓度参差不齐，相差悬殊(1扩一10oCFUm1)，为了提高真菌感染率和维持时fBJ，人多数动物术薹；16虹2006 htl碗研究审毕廿论炙d口应用糖皮质激素或免疫抑制剂处理。仍足这螳方法均不能真实模拟人角膜感染真荫的自然病张，肇质江射希I针刺划痕法破坏了角膜的IF常结构，井H针刺造成角膜表面的创伤深浅不一，无统一的标准；糖皮质激素和免疫抑制荆改变了动物的全身及局部免疫状态，改变了局部炎症细胞和细胞因f的分靠，人为的干扰了真菌毒力与宿毛iF常
15、lll!御力相互作用的过程，所以增加了真菌感染的病因学、发病机制、组织病理学、免疫学及分孑生物学等方面研究的局限性和不确定位。(二)角膜表层镜法角膜表层镜法为我所首创，曾庆延等119，201曾应用于建立兔角膜真菌感染的动物模型，真实模拟真菌自表面感染角膜的过程，达到了良好的效果。此方法刮除角膜上皮，去除了上皮屏障，降低了宿主的防御能力，增加了真菌的易感性，符合人真菌性角膜炎大多有外伤史的特点，且方法简单易行，深浅及面积易控制，标准统一，对基质结构无损伤，并可以研究真菌与上皮基底膜的黏附机制及感染的初始过程，我所曾庆延、董晓光等H9珥曾用此法研究常见致病真菌与兔角膜上皮基底膜的黏附机制。本实验中
16、因为小鼠眼球小，角膜薄(268鲣2gipm)，缝合角膜植片困难，易致角膜穿孔，诱发新生血管，所以覆盖大鼠角膜片后，缝合眼睑以防止植片脱出。大鼠角膜片与刮除上皮的角膜表面之闻接种菌液，遵循了真菌自表面感染角膜的自然发病过程，并且层问液体靠表面张力的作用可以维持恒定量，同时角膜片能够避免泪液冲刷，层问提供温暖潮湿的局部环境，利于真菌从孢子向菌丝转换，使菌丝充分接触上皮基底膜并保证稳定的接触时日J，增强真菌的侵袭能力(三)宿主动物的选择全身其他器官真菌病动物模型研究显示小鼠为多种真菌的易感动物，是真菌病动物模型中最常用的种动物123241，且与兔比较，小鼠与人的基因更相近，更利于用来研究真菌性角膜炎
17、的免疫学和分子遗传学机制。Tzu GWu等唧1利用针刺划痕法，应用塘皮质激素和免疫抑制剂预先处理小鼠，可以建立白色念珠菌性角膜炎小鼠模型，并发现近交系和远交系小鼠角膜真菌感染无明显差异，但是近交系或远交系的不同种问是否有差异未见报道，尚需进一步研究。在全身真菌病动物模型研究中发现阱l，小鼠对真菌的易感性存在品系差异，如荚膜组织胞浆菌对小鼠感染存在品系差异，敏感品系C57BUlosn，耐受品系AJ，sJLJ。SWRJ；皮炎芽生菌感染的敏感品系C3HHeJ，耐受品系DBAIJ，中BJ品系BALBc!st，C57BUl0J：AJ小鼠对新型隐球菌敏感，而C57BL6J小鼠则有耐受性因此，角膜常见致病真
18、菌足否存在易感动物及敏感品系，至今未见报道，尚需进一步实验筛选。虽然小鼠眼球小，角膜薄，手术操作l14难，感染后供研究的标本少，不利f第17负2006脯硕f研究q毕廿论文溃疡形念学的观察，但足，我们在实验中发现感染初期町以观察剑I魄!il：，内皮斑、前房积脓等特征性表现，只是存在时问较jji，溃疡变化较快。(四)菌液的浓度和闭合眼院时日j目前对于接种真菌旃液的浓度尚无统杯准，即使同一种方法浓度也相差悬殊。我们通过浓度梯度分组实验发现三种真菌浓度103CFUmi，iO山菌液(t06cl：u)即可以提供足够的孢子接触角膜表面，降低浓度影晌感染率，增加浓度对感染率及持续时间无明显影响。Wu TG等1
19、20l发现随着接种真菌数量的增加(102一l旷CFU)，建立动物模型的成功率升高，要获得比较稳定的感染率，接种真菌孢子数至少要达到106CFU，与我们的实验结果基本一致。另外，我们实验中为了弥补缝合眼睑时挤压出菌液数量，闭合跟睑后再次注射5m菌液，而且小鼠的麻醉状态大约持续8一lO个小时，避免了眼呤活动的挤压作用，可以为孢子向菌丝阶段转化提供稳定的环境和充足的时目j，并且在拆除眼盼缝线时发现，眼内分泌物凝固于聆裂缝隙处，结膜囊基本处于密封状态，即使小鼠清醒后眼球转动，菌液也不能溢出我们按照相同浓度，不同闭合眼喻时问分组实验发现，烟曲霉菌和茄病镰刀菌延长闭合眼睑时问明显提高感染率和临床评分，拆除
20、眼睑缝线时如果缝线松脱，则角膜感染较轻或不感染，说明充足接触时fBJ可能也是影响感染成功率的重要因素。其具体机制可能为真菌孢子必须转换为菌丝阶段，完成表型转换，彳+具有侵袭能力，进一步侵犯角膜，丽这一过程可能需要一定的时阃，且不同真菌所需要的转换时间可能不同ODay DM等11 7J研究发现，裸露而未受损伤的角膜基质只对真菌菌丝易感。但是不同种属真菌孢子转换为菌丝阶段的具体时问及机制尚不清楚，需要进一步实验研究三、真菌的毒力和生长方式白色念珠菌浸润角膜基质内密集，菡丝纤细，于后弹力层处聚集，并且头端膨大，穿入前房后菌丝明显粗大，有隔菌丝增多，说明角膜基质的致密板层结构及后弹力层具有一定抵抗真菌
21、菌丝侵蚀、限制菌丝生长的作用。烟曲霉菌菌丝呈粗短管状，有隔菌丝多，成簇分布，浸润角膜全层，菌丝在角膜基质内的浸涧形态明显不同。本实验茄病镰刀菌初始是用Sabouroud培养基培养，反复培养数次，镜检孢子数均较少，接种感染率极低(30)，换用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养1周，涂片镜检孢子数显著增多，接种感染率明显提高，接种第2、3天即可穿透角膜进入前房，甚至穿透晶体囊膜，显示活力和，或毒力增强，说明嗣一株真菌不同的培养方式可麓影响其生物特性，进而影响其感染率。我们在108例真麓角膜炎的临床特点和组织病理学研究125l和5l例板层角膜移植的真菌性角膜炎患者组织病理及培养研究15 J发现，人角膜茄病镰
22、刀荫感染，荫第18虹2006肼坝f研，牛牛竹沦艾煌，F长方式毛要是平行基质板层的水平生长趋势，曲锈菌属农现为睡汽生长趋势。但是Vemuganti等【28I对】67例真菌性角膜炎患者角膜片行组织学和微，卜物学研究表明菌丝在角膜中的生欧方式与菌属无关。分析原凼-叮能与宿上人剃-篾片、菌株不同、病程长短不同及治疗措施的差异等等有关为排除一些不确定冈素，曾庆延、董晓光等11920l建立真菌性角膜炎兔模型进一步研究发现，肺病镰月菌在兔角膜基质内呈水平生长趋势，烟曲霉菌和白色念珠菌呈垂直生长趋势，并进一步研究其机制可能与MMP-9有关。本实验3种常见致病真菌组织病理学检查见菌丝于角膜基质内的生长方式总体上
23、均呈垂直生长趋势，即角膜基质内大多数菌丝具有垂直于角膜板层纤维向深基质层浸润的生长趋势，其中白色念珠菌和烟曲霉菌与兔模型结果一致，而茄病镰刀菌菌丝在小鼠角膜内呈明显的垂直生长趋势，与兔角膜内水平生长趋势明显不同，并且裂隙灯观察和组织病理学检查均不同。两种模型感染菌株相同(31829)，马铃薯葡萄糖琼脂培养基及动物模型的建立方法均相同，所以说明同一菌株在不同物种宿主角膜内可以表现出截然不同的生长趋势，其原因可能与宿主角膜的组织结构、宿主的防御能力及其与真菌毒力的相互作用不同有关，具体机制尚需进一步实验研究我们应用临床上茄病镰刀菌感染病人的分离株经培养后接种至小鼠角膜(D组)，发现其菌丝均呈垂奁生
24、长趋势，并穿透小鼠角膜及晶体囊膜，但查阅此患者病历发现其感染20余天，应用抗真菌跟水及碘酊烧灼等治疗，效果欠佳而于我院行部分板层角膜移植，术后效果良好切除角膜片组织病理学检查菌丝呈水平生长趋势，且浸润较浅，是否可以从一个方面说明真菌在不同宿主内生长方式不同，当然也不能排除药物治疗的作用。组织病理学检查发现菌丝大多浸润角膜中央，菌丝浸洞处炎症细胞较少，溃疡周边部大量炎症细胞浸润，与真菌性角膜炎常见的临床表现免疫坏符合。据研究表明12丌，白色念珠菌可释放特异性作用于多形核自细胞的物质，抑制多形核白细胞的趋化、吸附和吞噬作用但是真菌性角膜炎常见致瘸真菌是否由此特性，未见报道，需要进一莎研究实验中观察
25、炎症后期基质和d妒房内的菌丝被大量炎症细胞包围，有的只见菌丝伪影，菌丝已被吞噬消化。Kiryu H等126l研究发现，在地塞米松处理过的兔角膜中，多形核白细胞不能吞噬、破坏菌丝，而末处理的角膜中，菌丝被多形核白细胞的伪足包围并逐渐被破坏。但是，自细胞在吞噬杀灭真菌的同时也释放多种水解酶，加重角膜炎症反应，说明小鼠角膜对真菌感染具有自我防御能力，角膜溃疡的程度取决于宿主与真菌相豆作用的趋向，而应用糖皮质激素或者免疫抑制剂必定影响角膜炎症细胞及细胞闪f等的作用，所以并不能用于免疫学机制的研究。馋19吐E2006桶懒I研究,j-牛帅论殳结 论l、在不应用糖皮质激素及免疫抑制剂情况下，改良角膜表层镜法
26、町以成功诱导BALBc小鼠白色念珠菌性和茄病镰刀菌性角膜炎，可以用于真菌性角膜炎发病CLSJl尤其免疫学及分子生物学等机制的研究；烟曲霉菌敛BALBc小鼠角膜感染率相对较低，自愈较迅速，可以扩大样本增加感染数黾田于早期发病机制研究。2，三种常见致病真菌菌丝在BALBc小鼠角膜基质内，长方式总体上均呈垂直生长趋势，具体机制需在后续的实验中进一步探索研究。3，与以往真菌性角膜炎兔模型研究对比发现，同一菌株(茄病镰刀菌)在不同物种宿主角膜内表现为不同的生长趋势。籀20撕2006 hi；坝f研究，F中ql,论史参考史献1Dunlop AAS，Wright ED，Howlader SA,et al，Su
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37、keratitis：Ahistologic and microbiologic study of 167 corneal buttonsOphthalmology2002；8：l 53846第23 1；(200611帧I埘彳牛牛廿沦虫=粘附分子与感染性角膜炎王殿强综述i穿参信审校山东省眼科研究所L摘要感染性角膜炎足一类主要的致亩僭眼病，尤其真菌性角膜炎发病率近年柬明显上升，占感染性眼病的比例逐年增大，其发痫机理的研究目前多集中于真菌的毒力方面，而关于机体防御能力对疾病发展的影响的研究甚少，粘附分子在介导炎症细胞迁移及调节局部免疫反应过程中发挥蓖要作用，本文就粘附分子在感染性角膜炎作用加以综述，
38、以期为真菌性角膜炎发病机理的研究寻找可以借鉴的途径关键词J粘附分子；感染性角膜炎；真菌性角膜炎感染性角膜炎主要包括细菌性，病毒性，真菌性等角膜炎，其致病机理是致病菌的毒力及诱发大量炎性细胞浸润对组织造成的破坏，炎性细胞包括多型核白细胞(PMNs)，淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞等，一方面吞噬致病菌，清除病灶，一方面释放各种酶如胶原酶，蛋白水解酶等溶解原纤维，促进溃疡发展。而粘附分子”“(adh商onmolecules，AM)在诱导炎症细胞自外周血管内贴壁，粘附，穿越内皮细胞及基底膜，向病灶游走聚集及调节局部免疫反应发挥重要作用因此研究感染性角膜炎粘附分子的表达，调节炎症细胞浸润可能提供一种新的治
39、疗方法。(一)粘附分子粘附分子是一类熊介导细胞与细胞或细胞与细胞外BJ质相互作用的塘蛋白分子。他们在免疫反应、细胞移动、免疫细胞的定位、免疫识别、免疫活性细胞的活化以及对于细胞外基质的识别等方面都有重要作用。分类：选择素(selectin)家族、整合素(integrin)家族和免疫球蛋白(immunoglobulin superfamily)超家族l、免疫球蛋白超家族这类分子具有与免疫球蛋白相似的分子结构，主要包括ICAM1(CD54，inlraceilularadhesionmolecule，细胞问黏附分子11，ICAM2，VCAMl(vascul卸rcelladhesionmolecule
40、，血管问黏附分子1)等。ICAM，l主要表达在内皮细胞、上皮细胞和淋巴细胞表面。VCAM-i是相对分子质量为105 000的单链糖蛋白，主要分布于血管内皮细胞，为VLA-4(CD49aCD29，very lateappearing antigen-4，很迟出现的抗原-4)的配体。2、选择素家族是介导内皮细胞，白细胞和血小板日J相互作用的一类黏附分子，其配体主要是SleX，可活化靶细胞或改变它们的功能状态，从而介导白细胞内皮细胞反应。依来源细胞不同可将选择素分为L。，E-，P，选择素等。L选择素持续表达于Ts细胞、中性粒细胞表面：E-选择素即CD62E，办称ELAM1(内皮细胞白细胞黏附分子一1
41、)，多系在炎症时由内皮细胞所合成，在中件粒细胞、一第24爽2006脯帧l研究叶毕廿沧史嗷细胞和某嵝记忆T细胞亚群七有其配体；P选择索“J内皮细胞合成并储存子内皮细胞或血小板颢粒内，在局部!l伤部位发生JnL液凝峒反戌时移至细胞表面。3、整合索有促进细胞迁移、伤口愈合、吞噬作用和靶细胞杀伤竹，H，分为3个业族：13。，B：，13，一整合素，其中B 2_整合索涉及细胞与细胞倒的枯附，13和Br整合索则主要与细胞外基质与细胞Ilj的粘附有关。LFAi(CDilaCD|8，ymphocyte function associated antigenl，淋巴细胞功能相关抗原1)和MACl(CDIibCDl
42、8，macrophage1)属于p z整合素，LFAl表达于淋巴细胞，髓样细胞(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞)，功能主要是介导T细胞和其他细胞(包括抗原递呈细胞)闻的粘附，两种配体：ICMAl(CD54)和ICAM2。与ICAM1结合，提供共刺激信号，促使T细胞活化，成为效应细胞；使T细胞表面抗原与递呈细胞之间的接触更稳定，并能增强T淋巴细胞的敏感性：可介导外周血自细胞贴壁粘附，向病灶游走聚集及调节局部免疫反应MAC1只表达于单核细胞、巨噬细胞、粒细胞及部分淋巴细胞，能与包括ICAM-|在内的多种配体结合。二)角膜粘附分子表达的研究正常角膜结构完整，无炎性细胞浸澜，各层组织不表达或低水平表达粘附
43、分子。1wata M等”。在人正常角膜上皮细胞未检测到ICAM1表达，进一步研究培养取自于角膜缘的上皮细胞，抗ICAM-1单克隆抗体和免疫组化方法发现ICAM1于培养角膜上皮边缘部分表达明显，这里PKC依赖机制的细胞运动活跃；用钙感光蛋白C，一种蛋白激酶C(PKC)抑制剂，处理培养角膜上皮细胞，抑制上皮细胞生长，发现经处理的上皮细胞ICAM1表达明显降低。提示ICAM，l可能与上皮细胞的运动或生长有关关于外周血淋巴细胞粘附角膜上皮细胞的机制，作者研究”发现是通过LAF-IICAMl和，或CD-2LAF3BCAM1途径实现，但关键途径主要是LAF一1ICAM1；两种分子的结合可被抗1CAMI或抗
44、LAF-1单克隆抗体所阻断；而IFNy和TNF-el不但增强ICAMl在培养角膜上皮的表达，而且加强淋巴细胞与角膜上皮细胞的粘附。正常角膜基质细胞表达ICAg-1很微弱，因为处于静止状态的基质细胞属于功能l型细胞，绝大多数为非增殖态的Go期细胞，当受到创伤或感染时，即可被激活，转化为成纤维细胞，进入增殖状态”1，而体外培养的基质细胞生理特性如体内激活的成纤维细胞，李海丽，吴静安等”1利用免疫细胞化学，流式细胞仪，日J接免疫荧光标记和检测等方法研究发现：体外培养的基质细胞可基础表达一定量的功能性ICAM-I，染色后于光镜下明显可见，主要位于细胞表面，经LPS(1011 gm1)和IFNy(500
45、Um1)作用后的细胞表达ICAMl明显比末加药细胞增强，两加药组之M镜下所见差别不大。加入LPS6小时ICAM表达水平大幅度一：升，12小时达高峰，24小时有所下降，说明LPS可直接作用r基质细胞。使其迅速第25撕2006I；坝I研究7I牛廿论史表达ICAM。1；IFN吖E要产生于角膜炎痢：的后期，足【I淋巴细胞衍7E的，对居质细胞表达ICAM1起卜调作用。ICAM一1通过与II细胞表【ffI的配体LAFl结合，对毖质内白细胞的聚集、粘附和活化呵能起促进作用，导至系列炎痖反心。Kumagai N等用不同浓度的TNF，n作用丁二培养的人角膜基质细胞证实基质细胞表达1CAM-I明显增加，并旱时问和
46、剂量依赖性；胛一PcR枪测剑大量IC,-lmRNA；与钙黄缘素一朋标记的中性粒细胞结合力明显增强。由此推断，炎症性眼病角膜基质细胞大量表达ICAM一1，促进了白细胞向角膜基质浸润。作者用不同浓度LPS作用于培养基质细胞，发现”1：角膜基质细胞含有LPS的受体复合体TLR“，CDl4，MD2；ICAM-l在细胞表面表达增加，基质细胞释放趋化因子IL一8和MCP1增多，即角膜基质细胞通过识别LPS后增加AM及趋化因子的表达，诱导白细胞浸润，在角膜防御系统中发挥重要作用。Claesson M等”研究了14例人角膜内皮细胞发现：基础表达一定量的NCAM(neural cell adhension mo
47、lecules)，而低水平表达ICAM1，VCAM，1，PEselcctin，HLA。DR。Yamaguchi K等”给大鼠注射内毒素(edotoxin，LPS)扫描电镜发现：内毒素可明显增强内皮细胞ICAMl表达，并与中性粒细胞与之结合密切相关Pavi lack凇等”在研究细胞因子对角膜ICAM-I表达及炎性细胞浸润的影响中发现：ICAM1低水平表达于未受刺激的正常的人角膜内皮，基质，角膜缘血管内皮细胞；细胞因子rlLl 13，r1NF-a，r11NY可不同程度的增加其在角膜各层中的表达并加强中性粒细胞与角膜细胞的结合； ICAM1在内皮细胞大量表达，介导内皮细胞与中性粒细胞结合形成KP；角
48、膜基质细胞大量表达lCAM1，诱导白细胞的游走和聚集于病灶，调节局部免疫反应。(三)细菌性角膑溃疡粘附分子表达的实验研究细菌性角膜溃疡中粘附分子表达研究较多的是绿脓杆菌性角膜溃疡，因其有自身的特点：症状严重，发病迅猛；细菌分泌的胶原酶和大量的多形核白细胞(PMNs)浸润导致宿主自身的免疫反应，致迅速的，进展性角膜基质液化性坏死，引起整个角膜基质溶解穿孔，眼内容物脱出或全眼球炎。虽然大量自细胞浸润促进了角膜的损害，但Hazlett LD等”“研究近交系白细胞减少症小鼠发现这些细胞能够清除活性绿脓杆菌，恢复角膜透明。HobdenJA等”将远交系小鼠分成2组：幼龄鼠(铺周龄)和大龄鼠(15-2年龄)，分别于感染绿脓丰丁菌6，12，24，48，72，96和120小时后做病理和免疫组化检查，发现虽然大体观察幼龄鼠角膜感染2496h后角膜病变重，而组织病理学榆查显示，与幼龄鼠比较大龄鼠于感染24-,48h角膜基质和内皮细胞很少有炎症细胞如多形核白细胞(PMNs)等浸润。而免疫染色显示只有幼龄鼠明显上调了角膜擘质细胞，上=皮细胞，内皮细胞，和结膜成纤维细胞和m管内皮细胞ICAM1的表达，而人龄鼠不第26“2006 JlIi帧I 6Jr究乍牛啦论史能L调ICAMJ一1表达。结果幼龄鼠角膜感染绿脓材菌瓜可恢复透明，而人龄鼠
