1、1 人用药品注册技术要求国际协调会 ICH 协调的三方指导原则 分析方法验证：正文和方法学 Q2（ R1） 现行第 4 阶段版本 最初指导原则起于 1994 年 10 月 27 日 （方法学补充指导原则完成于 1996 年 11 月 6 日，于 2005 年 11 月合并） 根据 ICH进程，本指导文件由相应的 ICH专家工作组提出，并提交给管理当局征询过意见。在 ICH进程第四阶段，最后的草案推荐给欧盟、日本和美国当局采纳。 Q2（ R1） 文件历程 原编码 历 程 日 期 新编码 2005年 11月 主 指导 原则 ： 分析 方法 的 验证 Q2 指导委员会批准作为第二阶段草案发布，对外征
2、求意见。 1993年 10月 26日 Q2 Q1E 指导委员会批准作为第四阶段草案推荐给 ICH三方的法规机构采纳 。 1994年 10月 27日 Q2 分析方法 验证 指导 原则 ： 主指导原则的补充 Q2B 指导委员会批准作为第二阶段草案发布，对外征求意见。 1995年 11月 29日 在 Q2(R1)中 Q2B 指导委员会批准作为第四阶段草案推荐给 ICH三方的法规机构采纳 。 1996年 11月 06日 在 Q2(R1)中 现行第四 阶段 版本 Q2A和Q2B 最初的指导原则现在更名为 Q2(R1)因为指导原则 Q2B方法学已经合并到最初的指导原则中。新标题“分析方法验证：正文和方法学
3、” 2005年 11月 Q2(R1) 2 目 录 部分 1： . 3 分析方法的验证正文 3 1. 介绍 3 2. 所要验证的分析方法的类型 3 表 4 术语 5 部分 2： . 7 分析方法的验证方法学 . 7 1专属性 7 1.1 鉴别 7 1.2 含量测试和杂质测试 8 2. 线性 . 9 3. 范围 . 9 4. 准确度 . 10 4.1. 含量分析 . 10 4.2. 杂质（定量） . 10 4.3 推荐数据 11 5. 精密度 . 11 5.1. 重复性 . 11 5.2. 中间精密度 . 11 5.3. 重现性 . 11 5.4. 推荐数据 . 11 6. 检测限 . 11 6.
4、1. 根据目测评价 . 11 6.2. 根据信噪比 . 12 6.3. 根据响应和斜率的标准偏差 . 12 6.4 推荐数据 12 7. 定量限 . 13 7.1. 根据目测 . 13 7.2. 据信噪比 . 13 7.3.1 根据空白的标准偏差 . 13 7.4 推荐数据 13 8. 耐用性 . 14 9. 系统适用性测试 14 3 部 分 1： 分析 方法 的 验 证 正文 于 1994年 10月 27日 经 ICH指导委员会 批准 通过 ， 作为 第四 阶段 草案 推荐 给 ICH的 三方 法规 机构 采用。 1. 介绍 作为递交给欧共体，日本和美国新药注册申请资料的一部分，对分析方法验
5、证需考虑事项的特征的讨论在此文件呈现出来。没有必要在此文件寻找覆盖在世界其他地区的药品的注册或出口所要求的测试。此外，此文作为术语的收集，和他们的定义而服务的，并没有想提供怎样完成验证的指示。这些项目和定义是连接那些常存在于欧共体，日本和美国的各种药典和规定之间的差异的桥梁。 分析方法验证的目的是为了阐述分析方法是适用于它要分析的目的的。应用于鉴别，杂质控制和含量测定方法的特征项的综合，可能考虑会加入到今后的文件中。 2. 所要验证的分析方法的类型 分析方法验证的讨论通常集中在以下分析方法的四个最通用的方面： - 鉴别试验； - 杂质含量的定量测试； - 杂质控制的限度测试； - 原料药或制剂
6、或其他药品中选择性的组分的样品的活性部分的定量测试； 虽然有许多其他的分析方法，诸如药品的溶解性试验或药品微粒大小测试，在分析方法验证最初的正文中并未给出。那些额外的分析方法的验证和在这里列出来的分析方法同样重要，且有可能在后来的文件中提出。 对于此文件中考虑到的测试的类型的简短描述如下： -鉴别试验是为了鉴定样品中某个分析物存在。通常将适当的样品与参考标准品进行比较（例如，光谱，色谱行为，化学反应等）。 -杂质测试是对样品中的杂质进行定性或定量试验。这两种试验都是为了准确的反应样品中杂质的特性。与限度试验相比，定量试验要求不同的验证试验项。 -含量测试方法是为了测定给定样品中的被测物的量。此
7、文件的内容中，含量测试代表4 原料药中的主成分的定量的测试。对于药物制剂中的活性组分或其他选择性组分进行含量测定时，相 似的验证特征也同样应用。同样的验证特征也可以应用到与其他分析方法相关联的含量测试中（如，溶解）。 分析方法的目的应该清晰易懂，因为它将制约需要被评价的验证特征。应考虑的典型的验证特征如下： 准确度 、 精密度 、 重复性 、 中间精密度 、 专属性 、 检测限 、 定量限 、 线 性 、范围 。 每一个验证特征在附属的术语中有定义。此表列出了那些验证特征，它们被认为是分析方法不同类型验证的最重要的部分。 此外，以下情况可能有必要重新验证。 -原料药合成路线变更； -成品组分变
8、更 -分析方法变更 要求重新验证的程度取决于变更的性质。某些其他变更可能也要重新验证。 表 分析 方法 的 类型 鉴别试验 杂质测试 含量测试 -溶解度 （ 只是 测量） -含量 /效 力 特征 - 定量 限度 - 准确度 - + - 精密度 ： 1.重复性 2.中间 精密度 - + - + - +（ 1） - +（ 1） 特异性 （ 2） + + + + 检测 限 - -（ 3） + - 定量限 - + - - 线性 - + - + 范围 - + - + - 表示此项特征通常不用评价 ； +表示此项特征通常要评价 ； (1)如果重复性（见术语表）已经履行，中间精密度不做要求 。 (2) 一个
9、分析方法特异性缺乏，可以通过其他支持性的分析方法补充 。 (3)某些情况下可能需要 。 5 术语 1分析方法 分析方法是指分析测试进行的方式。 它应该详细地描述执行每个分析试验的必要的步骤。可能包括但不限于：样品，参考标准品和试剂制备，适用的仪器，标准曲线的产生，采用的计算公式，等等。 2 特异性（专属性） 特异性是指清晰地评价组分中认为可能存在的被测物的能力。典型的包括：杂质，降解产物，辅料等。 一个单独的分析方法的专属性缺乏，可以通过其他可支持的分析方法来补充。 此定义有以下含义： 鉴别：确保某个分析物的身分。 纯度测试：确保所执行的所有分析方法对被测物的杂质的含量有一个准确的陈述，如，有
10、关 物质测试，重金属，残留溶剂，等。 含量测试（含量或效力） ： 提供准确的结果，对样品中被测物的含量或效力有准确的陈述。 3. 准确度 分析方法的准确度表达 了可接受值，包括常规真值或可接受的参考值，与测得值之间的一致性的接近程度。 4精密度 分析方法的精密度表达了，在给定条件下，获得的一系列的同一均匀样品的多次取样的测量值之间的一致性的接近程度（分散度）。精密度可以从三个水平考虑：重复性，中间精密度。重现性。 精密度应该用同一均匀，权威样品进行考察。然而，如果不能获得同一均匀样品，可以用人工制备样品或样品溶液进行考察。 分析方法的精密度常用一系列测量值的变异，标准偏差，或变异系数来表达。
11、6 4.1重复性 重复性表示在短期时间间隔内，同样操作条件下的精密度。重复性也叫批内分析精密度。 4.2中间精密度 中间精密度表示在同一试验室下的变异：不同天，不同试验者，不同仪器，等。 4.3重现性 重现性表示试验室之间的精密度（合作性研究，通常用于分析方法学的标准化）。 5检测限 一个分析方法的检测限是样品中分析物能被检测到但是没必要作为精确值定量的最小量。 6定量限 一个分析方法的定量限是样品中分析物能够定量测定，具有合适的精密度和准确度的最低量。定量限是样品基质中最低含量的化合物的定量分析的一个参数，特别用于测定杂质和/或降解产物。 7线性 分析方法的线性是获得的测试结果与样品中被测物
12、的浓度成直接比例的能力。 8范 围 分析方法的范围是样品中被测物的最高浓度和最低浓度之间的间隔（包括最高和最低浓度），在此区间内，已经证明分析方法有合适的精密度，准确度和线性。 9耐用性 分析方法的耐用性是，在故意对分析方法的参数进行微小变化后，方法仍然能保持不受影响的能力的一种测试，并且提供在正常范围内使用的可靠性说明。 7 部分 2： 分析方法的验证方法学 于 1996 年 11 月 6 日 经 ICH 指导委员会 批准 通过 作为 四 阶段 草案 ， 并于 2005 年11 月 并入 主指导原则 中， 推荐 给 ICH 的 三方 法规 机构 采用。 介绍 最初文件给出了分析方法验证中应该
13、考虑到的特征的讨论，此文件是最初文件的补充。它的目的是，在关于怎样考虑每个分析方法的各种验证特征方面，提供同样的指导和荐意 。一些情况下，（例如，特异性的证明），为了确保原料药或制剂的质量，可以考察多个分析方法结合的全面的能力。此外，文件给出了在注册申请中要呈报的数据指示。 所有在验证收集的相关的数据和用于计算的公式应该总结和做适当的讨论。 此指导原则中前面的那些方法以外的方法，也是可以应用或可以接受的。选择最适合于申请者的验证方法和草案，这是申请者的职责。由于性质复杂，生物和生物技术产品的分析方法在某些情况下可以和此文件中的方法不同。 在验证研究过程的始终，应该采用有备有文件的纯度，性能好的
14、参考物质。必须达到的纯度取决于应用的要求。 根据最初文件，为了更清楚，此文件在不同的部分考虑到各种验证的特征。这些部分的安排反应了分析方法发展和评价的过程。 实际上，设计实验工作通常是可能的，这样能同时考虑到适当的验证特性，来提供对分析方法的能力的彻底的完整地认识，例如：特异性，线性，范围，准确度和精密度。 1专属性 专属性研究应该在鉴别试验，杂质鉴别试验和含量分析中进行。用于证明专属性的方法取决于分析方法的分析目标。 常常不太可能证明一个分析方法对于特定的分析物（完全区别）是专属的。在这种情况下，建议结合使用两个或多个分析方法来达到区别的必要水平。 1.1 鉴别 8 适当的鉴别试验应该能区
15、别可能存在的结构相似的化合物。一个方法的区别可以通过获得含被测物样品的肯定的结果（可以通过与已知参考物质比较），和不含被测无样品的否定的结果来证实。此外，鉴别试验可以运用到与被测物结构相似的或相关的物质中来证明不能得到正反应。这类潜在的干扰物质的选择应该依据彻底的科学的判断，全面地考虑可能产生的干扰物。 1.2 含量测试和杂质测试 对于色谱方法，代表性的色谱图应该用于证明专属性，且各个单独化合物应该适当地标记。相似的考虑应该用于其他分析技术。 色谱中临界性的分离应该进行适当程度地调查。临界性分离能够通过洗脱出来最接近的两个化合物的分离度来证 明。 在含量分析方法不具有专属性的情况下，其他支持的
16、分析方法应该用来证明全面的专属性。例如，采用滴定法测定原料药释放度的含量时，含量测定和适当的杂质试验可以结合使用。 含量分析和杂质测定的方法的方法是类似的。 1.2.1 杂质是可以得到的 对于含量分析，需要证明在杂质和辅料存在的情况下区别出被测物；实际操作中，可以将一定量的杂质和 /或辅料加入到纯物质（原料药或制剂）中，证明含量分析结 果在这些物质的存在下不受影响（通过比较不含加入物质的样品）。 对于杂质测定，此项证明用在原料药或制剂中加入一定量的杂质，证明单独分离这些杂质和 /或将其与同样样品基质中的其他组分的分离开来进行。 1.2.2 杂质不可以得到 如果杂质或降解产物标准品不可以获得，特
17、异性可以通过比较包含杂质或降解产物的样品的测试结果和另一个性能良好的分析方法，例如：药典方法或其他有效的分析方法（单独的方法）。适当地，应该包括在相对激烈条件下：光，热，湿度，酸 /碱，氧化和还原。 -对于含量分析，应该比较这两个结果； -对于杂质测定，应该比较杂质的图形。 峰纯度测试可能对于表明被测物色谱峰不是多于一个组分的峰归属（例如，二级管阵列9 DAD，质谱）很有用。 2. 线性 应该在分析方法的范围（见第 3 部分）内评价线性关系。可以用指定的方法，直接证明原料药（通过标准溶液的稀释液）的线性和 /或制剂组分的合成混合物的分别的权重来证明其线性。 线性应该通过被测物浓度或含量的信号图
18、作出可视检测图来评价。如果有线性关系，测试结果应该通过合适的统计方法来评价，例如，用最小二乘法的一级回归线来计算。在某些情况下，为了得到含量测试结果和样品浓度之间的线性，测试数据可能需要在回归分析之前经过数学转换。线性回归得到的数据本身可能有助于提供线性程度的数学评价。 应该给出相关系数， y-截距，线性回归的斜率和剩余平方和。包括 给出数据图。此外，从线性回归得到的实际数据点的偏差分析对于评价线性也非常有用。 一些分析方法，例如免疫分析，在任何转换后没有进行线性。这种情况下，分析相应应该通过样品中被测无的浓度的合适的功能给与描述。 对于建立线性，最少要求 5 个浓度点。其他方法应该适当调整。
19、 3. 范围 特定的范围通常来源于线性研究并且取决于分析方法预定的应用。通过证实分析方法提供的线性，准确度和精密度的可接受度建立范围，测定的线性，准确度和精密度时，所用到的样品中含被测物的量应在分析方法指定的范围内或是在范围的极值。 应该考虑到以下最小指定范围： -对于原料药或是成品（药物）制剂的含量分析：通常是测试浓度的 80120%； -对于含量均一度测试，覆盖测试浓度的最小范围是 70130%，除非一个更宽的更合适的范围，根据剂型的性质（例如，压入型吸入 剂），可以作出适当的调整。 -对于溶解度测试：在指定范围的 +/-20 %； 例如，如果控释制剂的规格覆盖的范围是从 1 小时后的 2
20、0%到 24 小时的 90%，标签声明的有效范围应该为 1-110%。 -对于杂质测定：从杂质的报告水平到规格的 120%； -对于有效的或是产生毒性或非预期的药效的已知杂质，检测 /定量限应该与杂 质应该控制的水平相当。 10 注：在研发期间执行的杂质测试方法的验证，可能有必要考虑到可能的限度的范围。 -如果含量和纯度测试作为一个试验进行，且只有用到一个 100%的标准品，线性应该覆盖从杂质报道的水平到含量分析规格的 120%。 4. 准确度 应该在分析方法指定范围内建立准确度。 4.1. 含量分析 4.1.1 原料药 测定准确度有几种方法可以用： a) 分析方法应用到已知纯度的被测物中（例
21、如，参考物质）； b) 将预定的分析方法与的结果与另一个良好性能的方法的结果比较，得到的准确度进行统计和 /或定义（独立程序参见 1.2）； c) 可以从已经建立的精密度，线性和专属性中推断准确 度 4.1.2 药物制剂 可以采用的集中测定准确度的方法： a) 按用于分析的已知药物制剂的量来药物制剂的各个组分进行混合，得到的样品采用分析方法进行分析。 b) 在不能获得药物制剂的所有组分的情况下，或者向药物制剂中加入已知量的被测物，或者与另一个良好性能的方法所得到的结果进行比较，都是可以接受的，此法的准确度要进行统计和 /或定义（单独方法，见 1.2）； c) 可以从已经建立的精密度，线性和特异
22、性项中推导准确度。 4.2. 杂质（定量） 应该用已知量的杂质加入到样品中（原料药 /制剂）来评价准确度。 在不能获得某种杂质和 /或降解产物的样品的情 况下，可以考虑将用单独方法获得的结果进行比较（见 1.2）。可以采用原料药的响应因子。 应该明确单杂或总杂是怎样测定的，例如重量 /重量或面积百分比，所有情况都与主要被测物相关。 11 4.3 推荐数据 准确度的评价需采用指定范围内的最少 9 个测定点，最少 3 个浓度水平（例如，用总分析方法测定 3 个浓度 /每个浓度 3 个重复样品） 准确度应该进行报道作为测定样品中被测物的已知加入量百分比回收率，或作为平均值与可接受真值的差异和置性区间
23、。 5. 精密度 含量测定和杂质的定量测定实验验证包括精密度研究。 5.1. 重复性 重复性的评价用到： a) 最少 9 个测试指覆盖分析方法的指定范围（例如， 3 个浓度 ， 每个浓度 重复 3 个 样品） 或 b) 最少 6 个测定值，浓度在 100%的测定浓度 5.2. 中间精密度 应该建立的中间精密度的程度取决于方法所要应用的环境。申请者应该建立分析方法的精密度上的任意事件的影响。要研究的典型变异包括不同分析天，分析者，仪器，等。没有必要单独考虑这些因素。提倡使用实验设计（矩阵）。 5.3. 重现性 重现性是通过内部实验室实验的方式来 评价的。重现性应该考虑在分析方法标准化的情况下，例
24、如，包含药典中的分析方法。这些数据不是市场授权档案的一部分。 5.4. 推荐数据 应该给出所考察的每种的精密度的标准偏差，相对标准偏差（变异系数）和置信区间。 6. 检测限 测定检测限的几种方法都是可以的，取决于方法是一个非仪器方法还是仪器方法。除了那些列表中的方法外的方法是也可能是可接受的 。 6.1. 根据目测评价 12 目测不仅可以用于非仪器方法也可以用于仪器方法。 检测限的测定是通过分析含已知浓度的被测物样品且建立可以检测的被测物的最低的浓度水平。 6.2. 根据信噪比 此方法只能用于表现出基线噪音的分析方法。 信噪比的测定，是通过比较测得的已知低浓度的样品信号和空白样品的信号，建立能
25、够监测的被测物的最低浓度所得到的。信噪比在 3 或 2： 1 之间通常被认为可接受的作为检测限的评价。 6.3. 根据响应和斜率的标准偏差 检测限（ DL）可以表达成 ： DL = 3.3/ S 此处 ： =响应的标准偏差 S =标准曲线的斜率 ； 斜率 S 可以从被测物标准曲线中计算出来。 s 的计算可以用各种方法，例如： 6.3.1 根据空白的标准偏差 大量的分析的背景响应得测定是通过分析一定量的空白样品并计算这些响应的标准偏差来执行的。 6.3.2 根据标准曲线 应该用在含被测物浓度在检测限范围内的样品研究特定的标准曲线。回归线的剩余标准偏差或回归线 y-截距的标准偏差可以作为标准偏差使
26、用。 6.4 推荐数据 应该给出检测限和用于测定检测限的方法。如果 DL 是根据目测或根据信噪比来测定的，相关的色谱的呈报应该认为其合理性是可接受的。 在检测限的估计值通过计算或推算得到的情况下，此推论可能随后要通过独立的分析适量的接近或在 检测限浓度的样品来验证。 13 7. 定量限 几种测定定量限的方法都是可以的，取决于方法是非仪器还是仪器方法。除了下面那些列举的方法外的方法都是可以接受的。 7.1. 根据目测 目测不仅可以用于非仪器方法也可以用于仪器方法。 定量限的测定是通过分析含已知浓度的被测物样品且建立可以定量测定的被测物的最低的浓度水平。 7.2. 据信噪比 此方法只能用于表现出基
27、线噪音的分析方法。 信噪比的测定，是通过比较测得的已知低浓度的样品信号和空白样品的信号，建立能够监测的被测物的 最低浓度所得到的。信噪比在 10： 1 之间通常被认为作为定量限是可接受的。 （ QL）可以表达成： QL = 10/ S 此处 =响应的标准偏差 S =标准曲线的斜率 ； 斜率 S 可以从被测物标准曲线中计算出来。 s 的计算可以用各种方法，例如： 7.3.1 根据空白的标准偏差 大量的分析的背景响应得测定是通过分析一定量的空白样品并 计算这些响应的标准偏差来执行的。 7.3.2 根据标准曲线 应该用在含被测物浓度在检测限范围内的样品研究特定的标准曲线。回归线的剩余标准偏差或回归线
28、 y-截距的标准偏差可以作为标准偏差使用。 7.4 推荐数据 应该给出检测限和用于测定检测限的方法。 检测限应该随后要通过独立的分析适量的接近或在检测限浓度的样品来验证。 14 8. 耐用性 耐用性的评价应该在研究阶段就考虑到，并且取决于研究条件下的分析方法的类型。对于方法参数的有意的变动，分析方法应该显示出可靠性。 如果测定是易受到分析条件的变动影响的，应该适当地控制分析条件或在方法中给出预防性声明。耐用性评价的一个结果是建立一系列系统适用性参数来确保分析方法不管在什么时候用都是有效的。 典型变异的例子有： -分析溶液的稳定性； -提取时间。 （ 1） 如果是液相法，典型变异的例子有： -流动相 pH 改变的影响。 -流动相比例改变的影响； -不同色谱柱（不同批号 /或不同生产厂家）； -柱温； -流速； （ 2） 如果是气相，典型的变异例子有： -不同色谱柱（不同批号 /或不同生产厂家） ; -柱温； -流速； 9. 系统适用性测试 系统适用性测试是许多分析方法的一个必不可少的部分。此项测试依据的概念是仪器，电子器材，分析操作者和被分析的样品组成一个能够如此评价的完整的系统。所要建立 的用 于特定方法的系统适用性参数取决于要验证的方法的类型。见药典附加信息。
