1、多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统在临床应用中的评价摘要目的:评价多肿瘤标志物蛋白芯片在健康人群的普查、肿瘤的早期诊断及监测预后的应用。方法:使用 HD-2OO1A 多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统（C-12）测定分析 8330例恶性肿瘤患者，9657 例良性疾病患者和 23531 例健康体检者血清 12 种常见肿瘤标志物(CA199，NSE，CEA，CA242，CA125，CA153，AFP，FER，f-PSA，PSA，-HCG 及 HGH)的水平。同时对恶性肿瘤组的 153 例阴性标本用 E170 全自动免疫分析仪进行比对分析。结果:恶性肿瘤组的阳性率(85.6%)显著高于良性疾病组(41.2%)和
2、健康体检组(7.03%)(P0.05)。C-12 对健康人群检测的特异性为 95%，对健康人群肿瘤的检出率为 0.2%。结论:多肿瘤标志物蛋白芯片检测技术具有较高灵敏度和特异性。运用蛋白芯片技术联合检测多种肿瘤标志物可以明显提高恶性肿瘤诊断的敏感性，可应用于预后及疗效观察，同时也可以作为无症状人群的早期肿瘤普查手段之一，对肿瘤高危人群的普查具有一定的指导意义。关键词:肿瘤标志物;蛋白芯片；化学发光分析Evaluation of Clinical Application of Detective System of Multi-tumor Markers Protein ChipABSTRACT
3、Objective:Identification of clinical applications to cancer diagnosis with multi-tumor markers protein chip and its speeificity and sensitivity in detection of non-caneer subjeets and healthy controls. Methods:The serum levels of 12 tumor markers，includingCA199，NSE，CEA，CA242，CA125，CA153，AFP，Ferritin
4、，Free一 PSA，PSA ， -HCG and HGH -benign disease and 23531 healthy examinations.Results:The Positve rates were measured with the detective system in 8330 malignant tumor Patients，9657 Patients with were(85.6%)in malignant tumor，(41.2%)benign disease and(7.03%)healthy groups，respectively.The malignant t
5、umor group had signifieantly higher positive rate than that of the controls.Conclusion:Combined measurement of multiple serum tumor markers using protein biochip technique can significantly increase the diagnostic sensitivity for malignant tumor， and can also be used as an earlier tumor-screening to
6、ol to asymptomatic people， especially to the high risk ones.KeyWords: tumormarkers;proteinbioehip; chemiluminescence assay肿瘤是严重危害人类健康的恶性疾病，其发病率和死亡率有逐年上升的趋势 1，故早发现、早诊断、早治疗是提高患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测在其诊断中有着非常重要的参考价值。多数研究者主张采用联合检测肿瘤标志物的方法,可弥补单项检测的不足,有助于提高肿瘤检出率 2。上海数康生物科技有限公司研制开发的 C-12 型肿瘤用蛋白芯片主要是指通过微细加工工艺在固体芯
7、片表面构建的微型化学分析系统,从而实现对 12 种肿瘤标志物的准确快速与大信息量的检测 3。本实验室采用该诊断系统自 2003年 1 月至今，对 8330 例各期肿瘤患者、9657 例良性疾病患者、163 例肿瘤术后监测者和 23531 名正常健康人群血清中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199 (CA199)、糖原 242(CA242)、糖原(CA125)、糖原 153(CA153)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、前列腺特异抗原(PSA)、游离前列腺特异抗原(f-PSA)、铁蛋白(FER)、-人绒毛膜促性腺激素(-HCG),人生长激素(HGH)含量进行分析。利用多因素判别分析探
8、讨其在临床诊断中的使用价值。材料和方法1.检测对象:恶性肿瘤组 8330 例均为本院 2003 年 1 月至 2008 年 4 月住院及门诊患者，经临床手术及病理检查确诊，男性 4693 例，女性 3637 例，年龄 15-89 岁，平均年龄 53 岁；肿瘤术后监测组 163 例，均为恶性肿瘤组患者经手术、放化疗后定期监测者，男性 91 例，女性 72 例。年龄 16-79 岁，平均 46 岁；良性疾病组 9657 例为同期住院及门诊患者，男性 4569 例，女性 5088 例，年龄17-81 岁，平均 49 岁；健康体检组: 健康体检者 23531 例,8-92 岁，平均年龄51 岁。2.血
9、清的检测方法：按照数康生物科技有限公司多种肿瘤标志物蛋白质芯片诊断系统进行多肿瘤标志物测定。3.检测项目的正常参考范围:试剂盒提供的正常参考值见表 1。表 1 C-12 蛋白芯片肿瘤标志物正常参考值肿瘤标志物 参考值 肿瘤标志物 参考值CA125 35kU/L NSE 13ng/mlCA199 35kU/L PSA 5ng/mLCA153 35 kU/L f-PSA 1ng/mLCA242 20kU/L -HCG 3mIU/mLCEA 5ng/ml HGH 7.5ng/mLAFP 20ng/ml FER 322ng/mL(男)；219 ng/mL(女)4. 评价方法: 分组统计阳性例数：如有指
10、标超过临界值即阳性(铁蛋白单独升高不计入阳性数)。5.统计方法 所有数据均应用 SPSS11.0 统计学软件处理。各统计学指标用均值士标准差表示。结 果1. 恶性肿瘤组与良性疾病组，健康体检组阳性率比较 恶性肿瘤组的阳性率(81.4%)显著高于良性疾病组(38%)及健康体检组 (7.5%)(P0.05)。结果见表2。表 2 蛋白芯片对各组检测的阳性率(%)组别 例数 阳性数 阴性数 阳性率恶性肿瘤组 8330 7130 1200 85.6良性疾病组 9657 3979 5678 41.2健康体检组 23531 1656 21875 7.03随机抽取蛋白芯片测得的 153 例肿瘤标志物为阴性的样
11、本同时用 E170 进行单个肿瘤标志的检测。结果显示没有显著性差异，蛋白芯片检测为阴性的单个肿瘤标志物检测亦为阴性。2. 恶性肿瘤组的检测结果 用蛋白芯片技术联合检测不同恶性肿瘤患者血清, 肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结直肠癌阳性率较高，分别为85.6%，88.7%，79.4%，69.9%，61.9%，76.4%。各种恶性肿瘤的肿瘤标志物的阳性率详见表 3（图 1） ，表 4。表 3 蛋白芯片检测常见肿瘤的阳性率组别 例数 阳性数 阳性率肝癌 1025 860 83.9胃癌 1268 785 61.9食管癌 768 427 55.6结直肠癌 1381 1055 76.4肺癌 2112 1
12、476 69.9胰腺癌 421 373 88.7卵巢癌 961 763 79.4子宫癌 156 89 56.9前列腺癌 126 80 63.5鼻咽癌 98 35 36.1睾丸癌 14 4 31.2图 1 蛋白芯片检测常见肿瘤的阳性率020406080100肝 癌 食 管 癌 肺 癌 卵 巢 癌 前 列 腺 癌 睾 丸 癌阳 性 率表 4 恶性肿瘤各种肿瘤指标的阳性率(总数 11256 例)组别 例数 CA199 NSE CEA CA242 FER -HCG AFP f-PSA PSA CA125 HGH CA153肝癌 1025 51.2 5.6 36.2 9.6 68.4 9.4 75.1
13、2.3 2.3 35.4 5.2 13.8胃癌 1268 56.2 6.1 57.6 39.3 74.1 15.8 11.9 0.35 0.51 61.5 4.87 19.1食管癌 768 37.5 0.2 16.7 9.7 53.5 6.2 0.1 0.2 0.6 34.5 0 8.5结直肠癌 1381 57.6 6.0 42.4 39.1 48.6 0 9.68 0.3 0.5 47.5 0.1 16.3肺癌 2112 18.7 13.6 40.8 21.8 70.6 7.52 1.6 2.3 5.6 47.5 6.8 11.5胰腺癌 421 74.1 0.9 50.6 53.4 61.3
14、 9.6 10.3 0.1 0.9 26.67 0.6 7.3卵巢癌 961 21.5 0.4 14.5 1.4 30.5 41.5 10.2 0 0 62.5 0.1 12.4子宫癌 156 12.2 1.8 49.1 13.7 42.3 22.8 13.9 0 0 60.3 13.1 9.5前列腺癌 126 10.8 1.9 3.9 0.7 20.9 0.1 0.8 65.7 80.9 0 0 4.6鼻咽癌 98 16.9 0.3 6.9 14.2 57.2 0.3 5.4 0 0 22.1 0 6.4睾丸癌 14 0.1 0 0 1.6 11.2 527 1.6 3.6 3.6 0 0
15、02. 肿瘤术后监测组检测结果：对 49 例 C-12 阳性的肺癌患者，52 例肝癌患者，14 例卵巢癌患者，48 例结直肠癌患者分别于根治性手术后第 3-4 周、第 6-9 周、3 个月、6 个月、12 个月进行跟踪检测。检测值在第 3-4 周明显下降，与术前检测值有明显差异（P0.05） 。但术后 3 个月，6 个月，12 个月血清肿瘤标志物之间无明显差异，见表 5。在随访过程中，5 例肺癌，6 例肝癌，1 例卵巢，4 例结直肠癌患者检测中出现阳性并呈上升趋势，后经临床检查如 CT，B 超或手术后病理检测确定为肿瘤复发或发生转移。表 5 C-12 阳性的肝癌组术前、术后肿瘤标志物血清水平(
16、XS)组别术前（ 52 例）术后 3-4 周（ 51 例）术后 6-9 周（ 49 例）术后 3 月（ 47 例）术后 6 月（ 40 例）术后 12 月（39 例）CA199 75.2483.72 44.5835.14 25.6524.38 20.5423.63 19.9817.44 19.5420.63NSE 3.252.24 2.112.15 2.943.11 2.442.33 2.101.98 2.831.17 CEA 39.4740.75 17.7518.34 7.7610.48 6.586.13 4.375.13 3.967.11CA242 15.6425.19 8.529.28
17、12.5411.73 10.7211.43 6.195.36 11.447.51FER 410.73125.78 211.1498.63 256.19111.61 278.51142.82 212.85101.77 199.52191.77-HCG 0.970.77 0.810.65 0.550.55 0.540.60 0.670.59 0.470.74AFP 332.73125.78 46.1458.63 19.1918.11 18.5116.82 17.8523.77 12.8530.77f-PSA 0.070.76 0.010.65 0.050.38 0.040.52 0.040.59
18、0.090.27PSA 4.634.77 3.653.44 2.554.15 3.542.60 2.670.19 2.882.34CA125 22.7325.71 25.1411.58 14.1924.61 19.5118.52 24.8511.77 17.1323.37HGH 2.070.76 3.164.21 2.993.38 4.264.52 3.212.88 3.795.27CA153 4.582.96 3.583.99 2.155.11 3.712.44 3.9671.58 2.773.453. 良性疾病组及健康体检组检测结果：良性疾病组肿瘤标志物的升高水平较恶性肿瘤为低，且以单项或
19、 2 项指标升高为主。23531 例健康体检者多种肿瘤标志物阳性 1656 例（铁蛋白单独升高不计入阳性数） ，总检出率 7.0%。经临床诊断其中 1489 例为良性疾病，追踪病史及进一步检查发现主要为慢性炎症、息肉、药物损害、子宫内膜异位症、妊娠等引起的肿瘤标志物升高。98 例经临床病理确诊为恶性肿瘤。69 例不明原因肿瘤标志物升高，现仍在追踪随访中。由表 6可以看出，良性疾病患者中，以单个肿瘤标志物升高为主，占 81.5%；而恶性肿瘤患者多以三个或以上肿瘤标志物同时升高为主（80.7%） 。表 6 肿瘤标志物阳性的健康体检者C-12 阳性个数 良性疾病（1489 例） 恶性肿瘤（98 例）
20、 不明原因（69 例）1 1214（81.5%） 7（7.1%） 56（81.2%）2 235（15.8%） 12（12.2%） 8（11.6%）3 31（2%） 50（51.1%） 4（5.8%）4 或更多 9（0.7%） 29（29.6%） 1（1.4%）讨 论恶性肿瘤在我国人口中的死亡率为 108.39/10 万,占总死亡人数的 17.9%,高居死亡原因的第二位。因此早期发现、早期诊断和早期治疗对肿瘤患者具有重要意义。血清中肿瘤标志物的检测是肿瘤诊断的重要手段之一。其临床应用价值广阔，但单指标检测往往存在特异性不强、阳性率偏低，特别是早期肿瘤的检出率不高等缺点。多肿瘤标志物联合检测可以克
21、服这一缺点，大大提高检测肿瘤的敏感性和特异性，得到临床的广泛应用。生物芯片是近几年发展起来的一种大规模集成化,简单快速的分析方法, 主要是指通过微细加工工艺在固体芯片表面构建的微型化学分析系统,从而实现对细胞、蛋白质、DNA 以及其他生物组分的准确快速与大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类:基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室。蛋白质芯片是利用芯片表面上的探针来捕获各种待检测的蛋白质,最常用的探针是抗体 4。目前，蛋白芯片技术己经被广泛应用于多种肿瘤标志物的检测中 5，6，7 ，蛋白芯片系统克服了传统蛋白分析方法的缺陷。可快速分析原始蛋白提取物或者血液中的多种蛋白质，同时提取血液、细胞或者组织
22、中多种蛋白质的信息。本实验检测结果表明:在无任何临床症状的体检者中，经多肿瘤标志物检测后，确诊恶性肿瘤 98 例，检出率 0.2%。在肿瘤患者经手术后定期监测的患者中 5 例肺癌，6 例肝癌，1 例卵巢，4 例结直肠癌出现阳性并呈上升趋势，后经临床检查如 CT，B超或手术后病理检测确定为肿瘤复发或发生转移。说明多肿瘤标志物检测对肿瘤的早期诊断和术后监测，判断预后具有重要的临床价值。本实验检测结果表明，对同一肿瘤患者多肿瘤标志物检测，可能同时出现几种肿瘤标志物阳性，这与肿瘤标志物的特异性不高有关。因此目前均提倡采用多种肿瘤标志物联合检测，以尽可能达到提高肿瘤诊断的灵敏度和特异性。我们实验研究发现
23、：CA199+AFP+CEA+FER 对肝癌诊断的价值较大，CA199+CEA+CA242+CA125 对消化道恶性肿瘤的诊断阳性率较高，CA199+CA125+CEA+FER 联合诊断有助于肺癌的早期诊断。C-12 芯片法对恶性肿瘤的检测总阳性率为 85.6%，与各相关病种的常规血清肿瘤标志物检测灵敏度接近，提示 C-12 芯片法的基本临床诊断价值是显著的。由于 12 项指标的联合检测，C- 12 蛋白芯片技术为许多常见的恶性肿瘤提供了多元化的阳性血清肿瘤标志物指标，如肝癌患者除 AFP 有一定阳性比例外， CA199 或/和 CEA 及铁蛋白也呈阳性。而对于单项肿瘤标志物阳性比例不高的肿瘤
24、如肺癌、乳腺癌、胃癌等，C-12 芯片法的联合检测可以发现多项肿瘤标志物呈阳性，这不仅有助于提高临床诊断的灵敏度，而且有可能为临床治疗提供有效的监测指标。体检人群中也有较高的肿瘤标志物阳性率,总阳性率达 7.03%,单项以 FER最高为 4.11%, CEA 次之(1.41%),CA125 和 CA199 为 0.36%和 0.69%,良性疾病患者 多以单项或 2 项肿瘤标志物升高，而 98 例肿瘤患者（同时做影象学检查,后经病理学检查确诊为恶性肿瘤。 ）三项以上指标同时检测到阳性的有 79 例，占80.7%。由此可见，使用多指标联合检测，对恶性肿瘤的检出具有更高的灵敏度和特异性。蛋白芯片技术
25、的建立为多肿瘤标志物的检测及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，但由于肿瘤细胞生物特性的复杂及多态性,到目前为止尚未找到一种特异性和敏感性达 100%的肿瘤标志物,即使联合检测目前比较成熟的和常用的肿瘤标志物,其敏感性也无法达到百分之百, 我们的实验研究显示 C-12 芯片法对恶性肿瘤的检测总阳性率为 85.6%，对体检人群的肿瘤筛查也具有较好的灵敏度和特异性。由于 C-12 芯片具有高信息量，高通量，低成本的特点，在适合肿瘤临床检测的同时，对肿瘤高危人群进行肿瘤体检筛查也具有显著的临床意义。由于已有的肿瘤标志物在灵敏度和特异性方面仍然不够理想，使用肿瘤标志物进行肿瘤检测仍然有
26、较高的假阳性和假阴性。利用肿瘤标志物对肿瘤患者进行诊断和筛查,仍需更进一步的完善和发展。参考文献1. 邹雄,张利宁,主编.分子免疫学与临床,济南:山东科技出版社.2002.2833002. 邹 雄.肿瘤标志在肿瘤早期诊断中的研究和应用发展J.中华检验医学杂志,2002,25(2):7172.3. Weinberger SR,Morris TS,Pawlak M.Recent trends in protein biochip technologyJ. Pharmacogenomics,2000,1(4):3954164. Chapman K. The Proteinchip biomarker
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