1、,第11章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白,下篇 动物细胞工程,本章主要内容,1. 动物细胞培养的概念、历史,2. 动物细胞培养的特点3. 动物细胞培养工具与条件 4. 体外培养细胞生长与增殖过程 5. 细胞株与保存 6. 动物细胞小规模培养 7. 动物细胞大规模培养 8. 动物细胞培养生物反应器 9. 动物细胞大规模培养影响因素 10. 动物细胞表达制备药用蛋白,11-1 动物细胞培养概念与历史,1、动物细胞培养（Animal cell culture）：是模拟体内 生理环境使动物细胞在体外增殖、生存的一种技术。包括： 原代培养：动物细胞进行首次传代前的培养过程。 传代培养：将原代培养细胞继
2、续转接培养的过程。,2、历史：,1907年,哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬 滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活了几周 时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培 养的先河。,法国学者卡雷尔（C（Carrell）设计的卡氏培养瓶1923年用于 培养鸡胚的心肌组织取得成功，极大推动了动物细胞培养 技术的建立。,1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养 的培养基。伴随着培养工具与培养基的不断完善，动物细 胞体外培养技术日益成熟。,11-2 动物细胞培养的特点,1、动物细胞无细胞壁，比微生物细胞大 2、动物细胞倍增时间长，生长缓慢 3、培养过程需
3、氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。,4、动物细胞间主要以聚集体形式存在。,5、原代细胞培养繁殖50代左右即退化死亡。 6、对营养需求更加苛刻，除常规营养外还需血清等。,7、对培养条件或环境极其敏感。 8、容易受污染。 9、大多需要贴附在固体或半固体表面才能生长。,（一）动物细胞培养特点,体外生长的动物细胞一般具有贴附性、细胞接触 抑制性、密度抑制性的特点。,悬浮型细胞：与微生物、植物细胞不同，动物 细胞中只有极少数细胞体外生长可在培养液 中悬浮生长，培养密度高、效率高。血液白细 胞、淋巴细胞、某些肿瘤细胞等属于此类细胞。P98,1、类型： 贴附型细胞：大多数哺乳动物细胞必须附着在 固体或半固体表
4、面才能生长，另外也包括细胞间相互接触。,（二）动物细胞培养类型与形态,接触抑制性 (Contact inhibition) 是指由 于动物细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象 （图）。由于这个特性，正常细胞并 不会相互重叠，而是呈单层细胞生长。,密度抑制(Density inhibition) 细胞接触汇 合成片后，细胞仍能进行增殖分裂。 但是当细胞密度达到一定程度后， 营养相对缺乏，代谢产物增多，发生 密度抑制生长现象。,（3）游走型细胞,细胞呈分散生长，一般不连接成片，胞质常伸出伪足和突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则，在器皿上生长位置不固定。此型细胞不稳定，外形不断变化，密度大时难以和
5、成纤维、上皮细胞相区别。包括单核巨噬细胞系统：白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。,（4）多形型细胞,多形型细胞是一些形态上不规则的细胞，包括细长型胞突和多角形胞体。多形型细胞不常见，体外培养呈现多形型细胞的细胞最常见的是神经原和神经胶质细胞。实际上，体外培养的动物细胞形态常受培养条件影响，呈现过渡形态。,1、培养工具,多为玻璃或无毒塑料制成的： 培养瓶的形状主要是适合细胞贴壁生长 和显微镜观察的扁平形状。 培养皿 培养管仪器包括：CO2培养箱、相差显微镜等。 目前大多采用微载体(多孔塑料培养板)作为介质培养贴附型细胞生长，类似悬浮培养效果。,11-3 动物细胞培养工具与条件,另外，同微生
6、物、植物细胞培养不同，动 物细胞培养的培养基与其他溶液不能经受高温灭菌，多采用40nm过滤除菌（例如支原体污染。,2、培养条件,温度：人类和哺乳类动物细胞培养适宜温度为 37。细胞对低温耐受性更强， 40高温数小时可使细胞死亡。,pH：哺乳动物细胞为7.27.4，耐酸不耐碱。,渗透压：细胞在高渗透压或低渗透压溶液中会发 生皱缩或肿胀，甚至破裂。 BSS溶液。,气体：细胞的生长代谢离不开O2和CO2 。 二氧化碳培养箱供应CO2 ，还可调节pH值 。,3、动物培养基,对于营养要求非常苛刻，包括必需氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅酶、激素、生长因子、血清等。,分为：天然、合成、无血清培养基三
7、种。,（1）天然培养基,常用动物血清（胎牛血清、小牛血清）、组织提取液 、鸡胚胎汁等。,优点：营养价值高，培养效果好,缺点：成分复杂、来源有限、成本较高,血清（serum）：纤维蛋白已被除去(如通过血凝 或去纤维蛋白法)的血浆。,血清的生物功能,1.提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机 物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必 须的物质。,2.提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺 皮质激素、类固醇激素（雌二醇、睾酮、 孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、 表皮生长因子、血小板生长因子等。,3.提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的 低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、 以及激素等，
8、转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细 胞代谢过程中起重要作用。,4.对培养中的细胞起到某些保护作用：,提供促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤。血清蛋白形成的粘度，可以保护细胞搅拌时免受机械损伤。血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清来终止内皮 细胞、骨髓样细胞释放胰蛋白酶的消化作用。,血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起 重要作用，如硒等。,（2）合成培养基,优点：成分已知，便于对培养条件进行控制。缺点：无法替代天然培养基中一些未知成分,解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此 互补,目前常用的合成培养基包括：MEM、DMEM、,RPMI1640、F12、M199等，具体配方参见本章附录
9、（P123）,例如,MEM培养基：厄尔利（Earle）于1951年开发成功 。含有少量氨基酸、维生素、谷氨酰胺以及必须的 无机盐，组成简单。,DMEM培养基：由杜尔贝科（Dulbecco）等在 MEM培养基基础上研制而成，增加了各已有成分的 含量，同时又根据葡萄糖高低分为高糖型（,4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型适 合生长较快、贴附性差的细胞（例如肿瘤细胞）培 养。,（3）无血清培养基,血清培养基的优点：含有丰富的利于细胞生长的 成分,血清培养基缺点：,（1）动物血清来源有限，价格高，不宜大量使用,.,（2）动物血清成分复杂且成分不稳定，使生长过 程不易检测控制。,（
10、3）虽然血清对细胞生长有效，但会对后期培养 产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。,无血清培养基,无血清培养基(Serum free medium,SFM)是不含 血清的动物细胞培养基，由基础培养基和添加已知组 分组成。试图全部替代血清成分。,基础培养基较常用的是DMEM、F12培养基。添加组分主要包括：生长因子、激素（胰岛素、胰高血糖素等）、结合蛋白与转铁蛋白、细胞外基质、酶抑制剂等。,4、动物细胞培养常用溶液,（1）平衡盐溶液（Balanced salt solution，BSS ） 主要由生理盐水和葡萄糖组成，具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。例如：Hanks液、Earl
11、e液（缓冲能力强）,注：酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂： 中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。,（2）培养基pH调整液,动物细胞对酸碱度要求十分严格，大部分合成培养液都呈微酸性，若灭菌前调整到标准值，灭菌后又会降低，因此pH调整液应单独配制和灭菌，在培养液灭菌后再加入调整pH值最好。常用pH调整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。,注：HEPES （4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种非离子两性缓冲液，其在pH 7.2 - 7.4范围内具有较好的缓冲能力：,（3）细胞消化液,使用目的：培养前让组织块消化解离成分散细胞，或传代培养时使细胞脱离器皿表面并分
12、散解离。,胰蛋白酶溶液：水解细胞间的蛋白质，使细胞分散，使用浓度0.125或0.25%，用无 Ca2+、 Mg2+的 Hanks或PBS缓冲液配制，pH值6.8-7.2，2-10分钟消化完后加血清终止反应。,乙二胺四乙酸二钠（EDTA）消化液：非酶性解离细胞，毒性小、经济、操作方便，使用浓度0.02%。注：若将两者结合使用，解离效果更好：EDTA：胰蛋白酶体积比=1：1或2：1,（4）抗生素溶液,作用：防止微生物污染。,常用抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉 菌素等。,通常是青霉素和链霉素联合使用：培养基内最终使用浓度 为 青霉素100U/ml、链霉素100微克/ml（双抗）。,1、动物细
13、胞体外培养的一般过程,一般经过：组织获得与消化、接种、原代培养、传代培养几个环节,11-4 动物细胞培养生长和增殖过程, 原代培养期 传代期 衰退期,图11-8 动物细胞培养过程生长曲线,2、动物细胞原代培养,原代培养（Primary culture）：从体内取出组织接种直接长出单层细胞到第一次传代培养前的阶段（一般持续1-4周）。,特点：在这个阶段，细胞有分裂但不旺盛，细胞多呈二倍体核型。这样的细胞称为原代细胞。,优点：细胞生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内的形态学特征，是药物测试、研究细胞分化等很好的实验材料。,2.1 组织块原代培养法,是比较常用早期简易的原代培养方法：,（
14、2）接种与培养：用吸管吸出组织块，放入培养瓶内，每小块间隔0.5厘米，使其均匀贴在培养瓶的壁上（可涂血清）。然后将贴有组织块的瓶壁朝上，加入培养液，塞上瓶塞，将培养瓶缓慢翻转使培养液覆盖组织块，倾斜置于37的CO2培养箱内静置培养。,（3）生长周期：一般情况下，组织块贴壁后24小时细胞就从组织块四周长出，24小时后可再补充培养液，3-5天即可形成单层细胞再更换培养液即首次传代培养 ，若5-7天组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落。,（1）组织块的分离：将组织块剪碎成1mm3大小，加Hanks缓冲液，用吸管吸打，离心，收集沉淀即为组织块。也可用注射器挤压，或用网筛分离得到细小的组织块。,2.2 组织
15、消化原代培养法,（1）取材与消化酶解法制备单细胞,根据不同的组织对象采用适当的酶消化液获得动 物细胞团或单个细胞，然后进行培养。,最常用的有胰蛋白酶和胶原酶，此外链霉蛋白酶、粘 蛋白酶、蜗牛酶等也可用于动物细胞的消化。 消化传代细胞常用EDTA与胰蛋白酶一起使用。, 胰蛋白酶法,适用消化细胞间质较少的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮、肝、肾等,胶原酶解：适用于结缔、上皮、癌组织等，使胶原酶最终浓度为200u/ml，36.5，静置448小时，上面悬液经离心获得或纤维细胞沉淀，沉淀重置于生理盐水，去掉未解向组织块后沉淀得到上皮样细胞。,组织消化原代培养示意图,1.检查细胞形态及活力：倒置显微镜下观察
16、培养瓶中原 代细胞，生长良好者轮廓不清晰，较透明；生长不良者 反而轮廓清晰，形态不规则，胞内有空泡、颗粒等。 四唑氮蓝法(MTT)法可以检测细胞活力：活细胞的线粒 体脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲暨 （Formazan)并沉淀在细胞中。2.培养液pH及污染检查：含血清的新鲜培养液呈桃红色，,pH在7.27.4之间。CO2的积累使培养液pH下降，,当超出缓冲范围时，培养液变黄，需要34天更换,一次培养液。CO2培养箱能自动控制5%的CO2含量。,细菌污染时培养液变浑浊；支原体易透过滤器，污染 不易被发现。,（2）原代培养期检查,倒置显微镜：组成和普通显微镜 一样，只不过物镜与照明系
17、统颠 倒，前者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培养的活 细胞，具有相差物镜。,3、动物细胞传代培养,传代培养（Passage culture/Subculturing）是指 将原代培养的细胞继续转接培养的过程，一般可传代50代左右。传代培养期间的细胞称为细胞系。,注意：每进行一次分离再培养称为传一代，即从 细胞接种培养到分离再培养期间的一段时间。在 细胞的一代中，细胞约能倍增36次。,传代培养方法,悬浮生长的细胞可以采用加入新鲜培养基后直接 吹打分散传代，或者采用自然沉降法加入新鲜培 养基后再吹打分散进行传代。,贴壁生长的动物细胞，原代培养细胞分裂增 殖扩展成片后需要进行细胞分离重新
18、接种培养。 一般采用酶消化法进行传代培养。,视频：动物细胞培养技术:,http:/ 旧培养液。,2、加入胰蛋白酶和EDTA混合 液盖满瓶底，轻轻摇动培 养瓶。,3、25分钟后检查，有细胞 间隙变大、细胞质回缩现 象时添加培养液终止消化 。,4、吸出消化液，加入Hanks 液轻轻转动，洗去残留消 化液。,5、加入培养液，用吸管轻轻 吹打瓶壁，使细胞脱落制 成悬液。,6、计数，接种进行传代培养。,动物细胞的传代培养,11-5 细胞株与保存,1.细胞系(Cell line),是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细 胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群 体。第一次传代培养后的细胞即称之为细胞
19、系。,不能连续培养的为有限细胞系(Finite cell line)， 能连续培养下去的为连续细胞系(Infinite cell line)。,2.细胞株(Cell strain),是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分 离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的 细胞群，称细胞株。,细胞株的建立需要从细胞系群体中分离出一个细 胞，并使其在体外繁殖成为新细胞群体。,3 动物细胞株类型,包括：,原代细胞、传代细胞,有限细胞系、无限细胞系（不具有接触抑制现象；理 想的药物生产细胞）,二倍体细胞、异倍体细胞,融合细胞、转化细胞、基因工程细胞,（1）原代细胞,常用有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞或鼠肾细
20、胞、血液 淋巴细胞,1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎组织细胞 生产脊髓灰质灭活疫苗，开创了动物细胞培养进 行生物制药的先河。,缺点：具有需要大量动物组织、成本高、费时费力等。,药物筛选、药理研究。,（2）二倍体传代细胞,二倍体细胞具有正常细胞的特点：二倍体染色体、 具有贴壁和接触抑制特性、无致瘤性。 有限细胞,系（传代次数一般都不超过50代）。,WI-38： 1961年Wister 38研究所从女性高加索人 的正常胚肺组织中获得的一株人2倍体细胞系WI- 38。培增时间24h；贴壁生长；第一批获得批准用,于生产的二倍体细胞有对病毒敏感，第一个用于疫 苗（脊髓灰质灭活疫苗）生产。,M
21、RC-5：二倍体，成纤维，生长比WI-38快。,（3）融合细胞,如杂交瘤细胞：脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合细 胞。用于抗体药物生产。,将药用蛋白基因转化入动物细胞培养，用于大量生产药物。,（4）基因工程细胞,（5）转化细胞,细胞转化是指细胞发生遗传改变而产生永生化， 即由限定性细胞系转化为连续性细胞系，可以在 体外进行无限传代和生长繁殖。,不同于癌细胞，没有致瘤性。倍增时间短，对培养条件与生长因子要求低。由于转化细胞常常由于染色体断裂而变成异倍体， 失去正常细胞的特点。转化细胞于20世纪80年代获得批准用于生产。,转化方法,1.细胞自转化,体外培养的细胞自发出现的转化现象。这种现象 在许多
22、正常二倍体长期传代过程中出现。可能的,因素包括：血清质量、温度或pH不稳定、病毒污,染等。,2.人工诱发转化,采用诱导剂使正常细胞发生转化。凡是可以改变,DNA结构的因素都可以称为诱导剂，包括化学、,物理和病毒诱导剂。,CHO细胞(Chinese hamster ovary cell)：从中国,仓鼠卵巢分离的细胞，亚二倍体，有多种突变株。 贴壁生长，也可以悬浮培养，对剪切力和渗透压 改变有较高的忍受能力。,CHO细胞能表达糖基化蛋白药物：组织纤维蛋白 溶酶原激活剂(Tissue plasminogen activator， tPA)、促红细胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、 乙
23、型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virus,surface antigen, HBsAg）、粒细胞集落刺激因 子（Granulocyte colony stimulating factor,G- CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。,比二倍体减少1条(2n-1)或几条染色体的细胞称亚二倍体,Vero细胞（Vero cell）:是1962年日本从非,洲绿猴肾中分离的细胞。成上皮型，异倍体， 贴壁型，是最常用的大规模培养的动物细胞 之一。,BHK-21细胞（Baby hamster kidney cell）：是 1961年英国从幼地鼠的肾脏分离的细胞。成纤维样， 异倍体。常用于增
24、殖病毒制备疫苗和重组蛋白(例 如重组凝血因子VIII)。,（1）先酶消化分散成单个细胞，用冷冻保护液（含10%血清的培养液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷却，同时将细胞稀释成25*106个/ml。 （2）分装： 1ml /安瓶 （3）冷冻机内冷冻至-25 （4）液氮罐长期冷冻保存。 （5）细胞复苏： 37水浴快速融化,4 动物细胞冷冻保存,1、悬滴培养, 是最早建立的体外培养技术，是组织和器官培养的经典方法。, 将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组,织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。,11-6 动物细胞小规模培养,2、灌注小室培养,
25、是在悬滴法基础上的改进，实现营养液的循环供应与流出。,3 培养瓶培养法,1923年，卡雷尔（Carrel）设计成功卡氏瓶，可 以保证动物细胞培养的无菌环境和生长空间。培养瓶培养法是目前动物细胞小规模培养的主要 方法之一。,培养对象直接接种于培养瓶内再放入培养箱,4 培养板培养法,接种在培养板孔（48、96）内，然后置于CO2培养箱培养。目前常规方法之一。,5 转管培养法,1933-1934年，盖尔（Gey） 和刘易斯（Lewis）建立了旋 转管培养方法，将培养物接 种于一管状培养器皿中，再 将其固定在一可以旋转的装 置上旋转培养。,旋转管培养方法克服了静置 培养的不足，例如：细胞生 长环境不均
26、匀、不利于营养 的吸收等，培养物可以交替 地接触培养液和气体环境， 利于细胞或组织生长。,6 转瓶培养法,将转管换成培养瓶，增加了培养液与空气接触面积,1 悬浮培养,是指细胞在反应器培养液中自由悬浮生长。,主要用于非贴壁依赖型的少数细胞培养：杂交瘤细胞、 血液白细胞、淋巴细胞，某些肿瘤细胞等。,贴壁型细胞贴附在微载体上或者包裹在微囊中后 可以接种在适当生物反应器中实现悬浮培养。,11-7 动物细胞大规模培养,优点：细胞呈单个游离态存在，传代时无需再消化分散；增殖快，产量高，培养过程简单。,2. 微载体培养,微载体（Microcarrier）：是直径60-250m的,带正电荷微粒（葡聚糖聚合物）
27、，适于贴壁型细胞生长。,1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。,微载体培养成既能满足动物细胞的贴壁要求，又能使微珠悬浮起来，实现3D培养，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制（面积有限，占用空间大，细胞产率低，监控不便，劳动强度大） 。,2.1 微载体特点,1.良好的生物相容性、无毒无害,2.有好的黏附性，一般带正电荷,3.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一4.良好的传质性能,5.强的机械性能：重复利用、保护细胞6.好的热稳定性：能高压灭菌,2.2 微载体分类,1.实心微载体,优点：易于细胞在表面贴壁，机械强度高， 容易接种操作,缺点：细胞浓度低；细胞容易受剪切力、搅 拌、碰撞等
28、影响；细胞易老化脱落。,2.多孔微载体,优点：比表面积更大生长空间大；内部生长可使 细胞免受机械损伤；易固定化培养，可以 采用高的搅拌速度和通气量，强化传质。,缺点：容易产生营养传递障碍，积聚代谢副 产物。,2.3 微载体培养细胞方法,1、选择合适的微载体类型：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等。,2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微载体3h，洗涤1次，高压灭菌。,3、接种：根据不同细胞类型决定接种浓度。细胞在微载体表面的贴附是关键，主要取决于细胞与微载体的接触概率和亲和性，也与培养基组成（血清提供促 接触和伸展因子）、要慢速搅拌等相关。多数细胞都可在24小时内贴壁。,4、培养与
29、观察、细胞计数：观察形态是否正常，并计数控制密度。,1.游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。,2.吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数 细胞都可在24小时内贴壁。,3.繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。 随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。出 现接触性抑制。,4.退化期：细胞长满载体表面，随着营养物的消耗和代 谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不 及时传代培养，细胞脱落死亡。,微载体细胞培养生长过程,2.3 微载体培养细胞方法,酶消化法：碳酸氢钠碱性溶液浸泡，贴壁性差，使细胞脱落； 用含EDTA的PBS缓冲液洗涤微球， 胰蛋白酶-EDTA 37浸泡
30、搅动消化15min后，血清终止,5、消化与细胞回收：细胞贴壁率高、细胞容纳量大等。,6、细胞收获：离心沉降法(400r/min,2min)或100um过滤法。,7、传代培养：“球传球”传代培养技术。,球传球接种技术,将贴满细胞的微载体与新鲜微载体混合，实现细 胞因随机碰撞而实现转移贴附在新载体表面的技 术。,优点：,（1）避免了细胞收获与微载体再生过程，方便、,高效。,（2）防止细胞调亡：通过定期更换微载体也能,为细胞的分裂生长提供了新的生长空间，在长期 培养过程中保持细胞活力，延长了细胞寿命，提 高了细胞分泌物的产量。,视频：,http:/ 养,中空纤维式：解决贴壁、营养气体有效吸收交换、
31、连续灌注培养,11-8 动物细胞培养生物反应器,细胞生长在由半透性的多孔膜制成的中空纤维中外表面。,柱式中空纤维生物反应器,中空纤维是一种细微的管状结构，管壁为极薄的半透膜。,主体是由微孔中空纤维管束制成的中空丝，纤维束由外壳包裹，因此可分为中空内腔与中空外腔两部分，每部分各有其进出口。新鲜培养液从中空内腔导入。气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体内部。,无菌空气进出口,中空纤维反应器,板框式：平行排列的中空纤维床,中心灌流式,优点：克服了纤维轴向流动时营养供应与产物积累存在的浓度梯度,多孔,通气,模拟细胞在体内生长的三维状态。,既可用于悬浮细胞的培养，又可用于贴壁细 胞的培养。细
32、胞如果是附壁性的，则附着在纤维 外壳表面，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其 消化冲出；若是非附壁性的，应采用微滤材料将 其截留在反应器内而让培养液排出。,优点：无剪切力影响，高密度培养，传质效 率高。,缺点：容易堵塞，价钱昂贵。,柱式中空纤维生物反应器评价,1、有毒物质或抑制因子产生,氨：来自培养基+代谢，积聚影响细胞生长和蛋白糖基化。,乳酸：来自细胞的糖代谢，抑制乳酸脱氢酶，抑制糖酵 解，能量产生减少，抑制细胞生长。,甲基乙二醛：脂类、氨基酸的代谢产物，对细胞有潜在 的损伤作用，改变有机物-NH3和-SH2。,CO2：毒害细胞或改变代谢水平、增大细胞渗透压。,11-9 动物细胞大规模培养的影
33、响因素,原因：营养成分耗尽、有毒产物积累,如谷氨酰胺的耗竭是最常见的凋亡原因，而且凋亡一旦 发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞 在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为 脆弱，更容易发生凋亡。,渗透压：影响细胞生长、死亡速度，影响产物积累； 载体：空间大小、孔隙大小，贴壁性、细胞移动性细胞死亡与凋亡：凋亡基因bcl-2,11-9 动物细胞大规模培养的影响因素,2、物理因素,参数控制：在线监控 pH、温度、氧气、搅拌等,灌注培养,1.减少细胞调,亡,（1）可以去,除氨、乳酸、 甲基乙二醛等 代谢物质。,（2）保证营,养供给。,2.连续性收获,产品,采取怎样的工艺操作才可以消
34、除细胞凋亡，保证高的细胞浓度？,11-10 动物细胞表达制备药用蛋白,大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基 化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳 定性及抗原性的前提。,转基因微生物在生产分子量较小、结构较为简单 的异源蛋白方面具有优越性，微生物表达系统合 成的复杂真核蛋白存在折叠方式不正确、缺乏翻 译后加工修饰等缺陷，动物细胞蛋白质表达系统 可以较好地解决这些问题。,1. 动物转基因方法,（1）物理法-电穿孔法,利用脉冲电场提高 细胞膜的通透性， 在细胞膜上形成纳 米级的微孔，达到 增加通透性的效果 ，从而使外源DNA 转移至细胞中。,简单、效率较高。,DEAE-萄聚糖法 早期使用
35、转基因法，效率低。 原理：带负电的DNA吸附在带正电荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成颗粒，通过胞饮作用进入胞内。,（2）化学方法,磷酸钙-DNA共沉法： 比前者高，但转基因效率还较低。 原理：形成磷酸钙-DNA沉淀颗粒，Ca2+能促使细胞膜脂裂开形成孔隙，使DNA进入，也可通过胞饮作用进入胞内。,脂质体载体包埋法将需转移的外源DNA或RNA 与脂质体混合，带负电的 DNA自动结合到带正电的 脂质体内形成DNA-阳离子 脂质体复合物。由于脂质 体具有磷脂双层结构，与 细胞膜类似，因此可以与 受体细胞膜融合，从而将 外源DNA转入宿主细胞。效率高。,逆转录病毒法,逆转录病毒是一种整合型 的单链R
36、NA病毒。,将目的基因重组到反转录 病毒载体上，感染细胞。病毒进入细胞后，利用宿 主细胞编码出反转录酶，将病毒 RNA反转录成dsDNA，再自行和 复制，再整合到宿主细胞DNA上，但机制不明确。,如牛乳头瘤病毒BPV，载体容量小（8KB）可表达干扰素、生长素等基因。,（3）生物学方法,2. 转染细胞与筛选,需选用在体外能无限生长的细胞作为受体细胞。采 异用特性选择标记用于快速有效地筛选转染细胞。 例如：,胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase,TK)： 当 转入TK-细胞时，其基因产物可使宿主细胞获得 对HAT培养液的抗性。,二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reduct
37、ase,DHFR),：缺失DHFR的CHO细胞不能合成 四氢叶酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培 养液上生长。转染dhfr基因的缺陷型CHO细胞可 在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。 此外还有：氨基糖苷磷酸转移酶APH、潮霉素B磷酸转移酶HPH。,3 目标蛋白高效表达策略,氨甲喋呤（Mtx）是动 物细胞关键代谢酶二 氢叶酸还原酶（DHFR ）的抑制剂，细胞经 过氨甲蝶呤处理后存 活下来的细胞中dhfr 基因得以扩增，提高 二氢叶酸还原酶的表 达水平，抵消氨甲蝶 呤的抑制作用，与dhfr 基因相邻的染色体片 段(可含目的基因)同样扩增。,4 动物细胞表达药用蛋白应用,中国仓鼠卵巢（CHO
38、）细胞表达制备促 红细胞生成素（erythropoietin,EPO）,溶血栓药物组织型纤维酶原激活剂（tPA）。,例1：tPA,第一个哺乳动物细胞表达 生产的医用蛋白是溶血栓 药物组织型纤维酶原激活 剂（Tissue plasminogen activator，tPA）。,将人的tPA cDNA克隆在含 有强启动子和终止子的表 达载体上，转染dhfr-细胞 ，用氨甲蝶呤处理培养， tPA随着dhfr基因大量扩增 ，新筛选出的转化株进行 大规模培养高水平生产人 的重组tPA。,例2 红细胞生成素EPO,红细胞生成素（erythropoietin ,EPO）,人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏
39、分泌的一 种激素样物质，为分子量67万的糖蛋白。,药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成 素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增 加血液中红细胞百分比）。,促红细胞生长素（EPO）属于基因兴奋剂，可 以增加人体内的红细胞数量，从而使肌肉获得更 好的氧供，增强运动员的耐力。,但是长期使用可使人体血液粘稠，增加心脏负 担，导致血液凝固、血栓等心血管疾病，甚至死 亡。,在2005年2月份的神经科学杂志上，西班牙 医生公布了一个病例，一位职业自行车运动员在 经常使用含有EPO的药物之后发生脑血管栓塞。,兴奋剂,生产EPO的CHO细胞工程,电激法,脂质体法,宿主细胞：,CHO：中国仓鼠卵巢分离的细胞,CHO-dhfr-细胞（二氢叶酸还原酶缺陷型）：缺失 DHFR的CHO细胞不能合成四氢叶酸，只能在添加 胸苷、甘氨酸和嘌呤的培养液上生长。,增加氨甲蝶呤的浓度，可提高与dhfr基因相连的外 源基因的表达水平。,例3：上海交通大学医学遗传研究所：,（1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝血因子IX 蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。,（2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试管牛 “滔滔”降生。,人凝血因子IX,
