1、实验二 多聚酶链式反应（PCR）与琼脂糖凝胶电泳,一、实验目的,掌握PCR的基本原理及其基本操作技术 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测水稻总DNA的纯度与分子量 检测PCR的结果,多聚酶链式反应（PCR）是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。 由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。,二、实验原理,1、PCR的原理,1）高温变性（94） ：使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA解离成单链DNA 2）低温退火（55）：引物和其互补的模板链3端结合，形成部分双链DNA 3）中温延伸（
2、72）：通过Taq DNA聚合酶使引物从5端向3端延伸，随着4种dNTP的掺入，合成与新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。,反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的DNA分子经20次循环扩增后可达106。,实验原理,2、琼脂糖电泳原理,电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。 电荷效应： DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下
3、向正极泳动。,实验原理,分子筛效应：不同的DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带，DNA的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应, 因而就可根据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把示踪染料或分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标记。 Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光强度与DAN含量成正比。,实验原理,DNA样品的纯度：植物总DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，表明所提样
4、品较纯；若在溴芬蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中含有RNA杂质；若所提总DNA在琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明DNA已严重降解。 DNA分子大小：与泳动距离相同的分子量标准参照物的DNA条带的分子量相近。,实验原理,三、实验材料、用具及试剂,实验材料：水稻总DNA 对照品种：P1（9311，籼稻）、P2（台中65，粳稻） 待测品种 ：每小组7个水稻品种 实验器具：PCR仪，电泳仪，电泳槽，电子水平，移液器，枪头， 2ml离心管，0.2ml离心管，三角瓶，微波炉等 试剂：dNTP，引物一对（编号为22179）， Taq酶，10PCR反应缓冲液， 灭菌双蒸水，琼脂糖，1
5、TBE电泳缓冲液， Goodview，载样缓冲液（Loading buffer）,10 PCR buffer：500mM KCl200mM Tris-HCl（pH8.3）0.01% 明胶 （ gelatin ）15-20mM MgCl2,1TBE缓冲液（1000ml）：电场中的导体载样缓冲液（6）：含指示剂溴芬蓝和二甲苯青，可在可见光下指示样品的泳动过程Goldview：荧光颜料，插入DNA双链中，使DNA在紫外光下显色,DNA分子量标准,1、PCR反应混合液的制备（1个样品，总体积20 l）0.2 l dNTP（10mM）2.0 l 10 PCR buffer（含15mM MgCl2）0.2
6、 l 引物F（10 M） : 22179F0.2 l 引物R（10 M） :22179R0.2 l Taq酶（5U/ l ） 15.2 l ddH2O Total 18.0 l 最后加 2 l 模板DNA， 混匀，放入PCR仪中开始反应,四、实验步骤,PCR技术,PCR反应混合液（总体积20 l）,混匀，取18.0 l分别加至0.2 ml PCR管中，最后每PCR管加 2 l 模板DNA，轻轻用手甩一下，放入PCR仪中开始反应。,PCR技术,2、PCR反应程序设计如下95 ，预变性3 min98 ，变性 30 sec55 ，退火30 sec 35个循环 72 ，延伸30 sec72 ，延伸5
7、min,PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约需要2小时。,PCR技术,3、制胶（浓度为2%）：,1）称取2.0g 琼脂糖，加入盛有200ml 1TBE电泳缓冲液的500ml蓝盖瓶中，摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，冷却到60 ，加入10l Goldview并摇匀。 2）将模具放入模板中，插入适当的梳子（18孔），将溶解的琼脂糖(约50 )倒入，在室温下冷却凝固成2%琼脂糖凝胶。 3）充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好，将凝胶置入电泳槽中（点样孔位于负极），加1 TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。,电泳技术,4、点样：用20l的移液器吸取10l样品混合物加入点样
8、孔中，样品将沉入点样孔下部。 1）吸取18l水稻总DNA+3l loading buffer, 混匀Mark DNA: 5l DNA-Hind 2） PCR产物+3l loading buffer，混匀Mark DNA : 5l 100bp DNA 5、电泳：打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm（约100V），注意电极方向（可见到溴酚蓝条带从负极向正极移动）；约30min后可观察 。,电泳技术,6、观察：将电泳好的凝胶置于凝胶成像系统下观察，根据电泳条带粗细和荧光强度，估计样品DNA的浓度和质量，以及PCR的扩增效果和分子标记（ 22179）的多态性；利用已知分子量的标准DNA条带的相对位
9、置初步估计样品的分子量；根据对照品种（籼稻：9311；粳稻：台中65）的带型，初步判断小组内待测品种的籼粳性。,1、由于PCR灵敏度非常高，因此应当采取措施防止反应混合物受痕迹量DNA的污染： 1）所有的溶液都应该没有其它核酸和核酸酶的污染； 2）PCR试剂配制所用的水均应是灭菌过的最高质量的双蒸水（ddH2O）； 3）所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性； 4）操作中所用的PCR管、离心管、枪头等都只能一次性使用； 5）吸取Taq酶、引物、 PCR buffer 等试剂的枪头均要使用灭菌的枪头； 6）每一次混合液分装（分
10、管）前均应充分混匀。,五、注意事项,五、注意事项,2、电泳时应注意如下几点： 1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60 ，否则温度太高会使制胶板变形，且易漏胶； 2）胶一定要充分凝固后才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔； 3）加样前注意点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多，点样时枪头垂直向下，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐； 4）一般情况下，不必每点一个样品都换枪头，吸电流缓冲溶液洗几次即可再点下一个样品； 5）凝胶中含有Goodview，有毒，切勿直接用手接触，废弃胶应集中处理，勿乱扔，不能污染环境； 6）紫外线照射不要太久，观察时应戴上防护观察罩。,六、作业,根据电泳结果，分析： 分析各自选择的水稻品种的DNA抽提质量和PCR扩增质量，并利用已知分子量的标准DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量； 分析分子标记22179的多态性，并根据对照品种（9311和台中65）的带型，初步判断本小组各待测品种的籼粳性。 注意：需在材料中注明小组和各自的水稻品种编号,23130bp 9416bp 6557bp,
