1、第五节 植物组织培养中常见问题及解决办法,组织培养中常见的问题,一、污染的问题二、褐化的问题三、玻璃化的问题四、其它问题,一、污染,（一）污染的原因,含义：组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。来源：细菌、真菌及其它微生物。原因：一是接种材料(外植体)带菌。二是培养基、接种器具带菌。三是操作人员接种不规范引起。,1、细菌污染,症状：培养基或外植体上出现粘液状或水迹状物，有强烈的酸臭味，多在污染后天内发生。 原因：外植体灭菌不彻底； 培养基灭菌不彻底； 接种用具灭菌不彻底； 母瓶带菌。传播：介质,细菌污染,2、真菌污染,症状：培养基或外植体表面出现白、黑、绿等色的块状菌丝(
2、孢子)。接种后天内发生。原因：接种空间不够密闭；室内潮湿，霉菌繁衍多；材料带菌；无菌操作不正确。传播：空气,真菌污染,真菌污染,（二）污染的预防措施,1、防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；春秋季节取材；材料预培养。2、严格外植体灭菌3、培养基(含接种用具)灭菌彻底4、严守无菌操作规程5、保持接种室、培养室清洁6、培养物污染后应及时高压灭菌后再处理,二、褐化及其防止措施,褐化：材料接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。,机理：植物组织中的多酚氧化酶被激活，产生醌类物质，呈棕褐色，当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，从而影响接种外植体的培养。,（一）褐变的原因,植物品
3、种（基因型）生理状态培养基成分培养条件,1）植物品种,由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有些品种的外植体在接种后不易褐变。,2）生理状态：,一般来说，老熟的组织在接种后褐变程度较幼嫩组织严重。,3）培养基成分：,浓度过高的无机盐会使褐化程度增加；细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。,4）培养条件不当,光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可加速被培养的外植体的褐变程度。,（二）减轻褐变现象发生的方法,（1）合适的外植体：一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体。（2）合适的培养条件：合适的无机盐成分、植物激素水平、温度等均可以
4、减轻材料的褐变现象。外植体诱导初期采取暗培养或弱光下培养可有效降低褐变现象的发生。,（二）减轻褐变现象发生的方法,（3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。培养基中添加0.1%0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。,（二）减轻褐变现象发生的方法,（4）连续转移：对容易褐变的材料可间隔1224小时培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理710天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,三、玻璃化现象及其防止措施,含义：离体培养物的嫩茎、叶片呈半透明水渍状的现象。属于生理失调症。症状：试管苗生长缓慢繁殖系数下降生根率下降移栽
5、成活率下降,（一）玻璃化产生的原因,培养基中激素浓度过高培养容器透气性差，湿度过高琼脂浓度低温度过高,（二）玻璃化现象的预防措施,增加琼脂用量，降低培养基的水势；采用通透性较好的容器进行培养；减少培养基中含氮化合物的用量；降低培养温度，进行变温培养；降低细胞分裂素用量增加光照,四其他常见问题和解决措施,（一）、初始培养阶段,1、培养物变色、坏死、茎断面附近干枯可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。,2、培养物长期培养几乎无反应,可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。改进措施：更
6、换基本培养基或调整培养基成分，增加生长素用量，试用2，4-D，调整培养温度。,3、愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状,可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。,4、愈伤组织太紧密、粗厚，生长缓慢,可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。,（二）、继代培养阶段,1、苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。 改进措施：增加细胞分裂素用量，降低温度，改善光
7、照，改单芽继代为丛芽继代。,2、苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化,可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。,3、幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中,可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当。改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。,（三）、生根阶段,1、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织可能原因：生长素种类、用量不适宜；PH值不适，无机盐浓度及配比不当。 改进措施：选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度等。,2、愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。,可能原因：生长素种类不适，用量过高，生根诱导培养程序不对。 改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低浓度，改变生根培养程序等。,（四）移栽驯化阶段,过渡苗死亡率高可能原因：组培苗质量差，环境条件不适，管理不精细改进措施：提高组培苗质量，改善环境条件，加强管理。,复习思考题,？,污染问题是植物组织培养中首先要解决的问题，对组培研究的成败有着至关重要的影响。结合你的实践经验，分析如何降低组培过程中污染现象的发生？,
