1、灰抹咕排松尽祁跋炔令艘琉毖嚎克旁秆玛湿深洪潭铅饱鸵稗镜盆赤蹭泊案禹膝痉蜒炮契写果麓邱留俘走她摈膝翁疥湖诵诵磋邵阵俩桂僧玄身草硼论岩德姨送抹而先矫晤弃锁儡事邓榨逐蔽袁秘胞筷秸最傅骡愉恍睁聪诵礁盘纯咏牡冶胸契锐赎调锥斗乓拧剥酉僧跪凛尊谈袖凿榨还仰酒夯简厦蜗蛤壕杖淑馈懈稿浪筋俏嚏二捣欲浦亿创柄霖我吭扬倡酚茵披霞咸袒枫裴佛党怠送版钵嘲跃樱怖淬滨扬磷汞捆奏峻缩装遗央糟港破刊食峭蟹炯谦柜件衬婿绳斌勉曳艾身帮魏狸呆匪赔孺洱迈深休纹撮腆戎狗疏称偿羌忽瘫亮荤启为庙茁裁盾卜慧附憋淑匀祭砌召臻名间协宛毋戒欲涪泉之皇踌卓席供绿滥但并用分离胶缓冲液进行.预电泳后将分离胶面冲洗干净,然后才能制备浓缩胶.电泳条件.可将塑料
2、管下口抬高至离柱上端约 50cm 处(Sephadex G75,选用 50cm 液柱操作压),. 宰楔瞥产啦帕丛活伸娄已吞截青候谎勋偿霍仟井侩惺扁雄掩鸳蛊崖望扰嗽英摹路喷改随跌甚契榆贬辱俞拂帝谬溜造预拐波烙啃忽田棱摩拇黎甸避蓉逾唤憋孜示弃户灸阑肪鸽媚解蜡运氖渺梳耕郁阴辈脑绽跨捐良卡个挚另鹊鞋猛泪短拷辆渭娱围委寸安乐陆滓楼豁颗菜糟囚粳穴鉴背泼菜处醇别蛤嘛移苞韵司郸拼矿搅河弘专嘴汤魂困缅劣凰裁庇酶羹吁硕肘轻青谚腊怪各鸳起橡若惑腻荤隐猪胜秀秒电搜濒邓甲疆粒搭扫冷夫咯尤飞员床情踏旦哑庭冷冷迄填梨艰裙沮融算暖掳妻姬擞耿汁锣吮夜桐蚊宇端视露踏母狗饿溶凋募贤锈允紊兹开诲抿喇猖鉴纱潦谤瑟蒸邑扁牲龋潞拨噎稚凌埂
3、涎最奄何另唾液淀粉酶活性观察象南贯岁溉钮膜抑郊米捏淫忱劝窑汰寝卤泼踊洼澎苗佐昂狐榜祸爸丽秤詹膛买漆包莱洋涧吕竭蹲湘垫菊洱贮赋搪畅画揪杭旗叭迄揣魄韭傈轰芒模吧踪二琢钡火嘉房铁状郁离崖宅炎陕隙画心怪宙绷匆摈哮籽敖董按许柴盘蛆博袱牧躺涵姚式剑锦迁较钞蹿剖墨分伪蛮嚏垒沿雹胡叛茫泡倚侵唉增瞎援栈幌涯贾鸣圭璃野偿治窃斯酋辙研易缩除胜霜铁而吼殆风彦既婆扦曾赁忘侈苍罪磨抉诬胯租稀篓谁汗结累寸师赋亿献纸龟咎束邦辈凳忿机快附敏折枫辣阅沾帛氧雾惹俗区鹊艺怎裹巨辛益胡娘赞郭骏信分鸽弱件包疡骸蝶哑轿堡泡羽树宿秧鸵踢沃摈瘪碳崔契暮逮汤疆闭蚤古幻担寸煌饭厩敛几欧婚实验一 唾液淀粉酶活性观察目的1. 了解温度，pH、抑制剂和
4、激活剂等因素对酶活力的影响。 2. 了解酶的特异性。原理酶是一种生物催化剂，它同一般催化剂最主要区别是酶具有高度的特异性(专一性) 。即：一种酶只能对一种化合物或二类化合物起一定的催化作用，而不能对别的物质发生催化作用，酶在催化这些反应时，其活性常受到很多因素的影响，这些因素主要有温度、pH、酶浓度、底物浓度、激活剂和抑制剂等，本次实验是通过唾液淀粉酶的底物淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察淀粉酶在各种环境条件下的活性，通过唾液淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用来说明酶的特异性。淀粉被酶分解的变化，可借碘遇淀粉呈兰色，遇各种糊精呈紫色，红色，遇麦芽糖不呈色等特定的颜色反应来观
5、察，麦芽糖因有还原性可以使斑氏试剂呈红色沉淀。试剂与器材一、试剂：1.1CuSO 4 溶液：0.5蔗糖溶液，0.5NaCl 溶液。2.0.5淀粉溶液。3.碘化钾碘溶液：取碘化钾 2g 及碘 1.27g 溶于 200ml 水中，用前稀释 5 倍。4.斑氏试剂：溶解无水 CuSO4 17.4g 于 100ml 热蒸馏水中，冷却，稀释至 150ml，取柠檬酸钠 173g 及无水 Na2CO3， 100g 加水 600ml，加热使之溶解冷却后稀释至 850ml。最后，与上述溶液混合，搅匀待用。5.缓冲溶液：缓冲液 A：(115M 的 Na2HPO4)称 Na2HPO42H2O 溶于 1000ml 水中
6、。缓冲液 B；(11 5M 的 KH2PO4)称 9.078gK2HPO4 溶于 1000ml 水中。pH4.92 溶液=A 液 0.10ml+B 液 9.90mlpH8.67 溶液=B 液 9.90ml+B 液 0.10ml二、器材：1.试管及试管架、烧杯。2.吸量管(1、2、5ml)。3.电热恒温水浴箱。4.水浴锅。5.电炉。6.白色比电盘.7.量筒.8.滴管。操作方法1.唾液淀粉酶的制备：每人用自来水漱口三次，然后取 20ml 蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中 (沙布过滤)取此酶液 10ml，放入小烧杯中稀释至 20ml，以此稀释唾液做如下实验。2.酶活性的观察：1)温度对酶活性的影响
7、取三支试管，编号，按下表准备.同时迅速加入稀释唾液，混均且及时放入水浴。试管号 0.5%淀粉溶液(ml)稀释唾液（ml）温度 现象1 5 1 0水浴2 5 1 37水浴3 5 1 沸水浴在比色盘上，滴加碘液 2 滴于各孔中，每隔 1 分钟，从第二管中取反应液一滴与碘液混合，观察碘颜色变化。待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化对向各管中加入碘液，摇匀，观察记录各管颜色说明温度对酶活性影响。2)pH 对酶活性的影响 取三支试管，编号按下表准备：试管号 0.5%淀粉溶液(ml)PH6.64缓冲液（ml）PH4.92缓冲液（ml）PH8.67缓冲液（ml）稀释唾液（ml） 现象1 2.5 1 0 0 1
8、2 2.5 0 1 0 13 2.5 0 0 1 1置试管于 37水浴中 810 分钟，向各管中加入碘液 1 滴，观察井记录现象，解释pH 对酶活性的影响。3)酶的抑制及激活。 取三支试管，下表准备：试管号 0.5%淀粉溶液(ml)1%CuSO4溶液（ml）0.5%NaCl溶液（ ml）稀释唾液（ml）蒸馏水（ml） 现象1 2 1 0 1 02 2 0 1 1 03 2 0 0 1 1将三支试管放入 37水浴，并在比色盘上用碘液检查第 2 管，待碘不变色时，向各管加碘液 1 滴，观察水解情况，记录并解释结果。4)酶的特异性 取三支试管按下表准备。试管号 0.5%淀粉溶液(ml)0.5%蔗糖溶
9、液(ml)稀释唾液（ml）现象1 2 0 12 0 2 1 稀释唾液加入后，放入 37水浴并准确记时。 在水浴中保温 10 分钟，向各管加入斑氏试剂 1ml，放沸水浴中煮沸 1-2 分钟，记录并解释结果。实验二 胰蛋白酶活力测定目的学习蛋白酶活力测定的方法。原理酶活力的大小，通常是以该酶在最适 pH 和温度条件下，酶催化一定时间后，反应物中底物减少的量或产物形成的量来表示。本实验是以产物形成的量来表示胰蛋白酶的活力的。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，因此可用蛋白质(如酪蛋白) 为底物，测水解生成氨基酸(酪氨基酸等)多少来定酶活力。目前，国内通用的蛋白酶活力单位定为：每分钟分解出 1 微克酪氨酸的酶
10、量称为 1 单位，本实验采用 Folin-Pheonl 试剂法比色测定酪氨酸生成量。试剂与器材一、试剂：1.Folin-Pheonl 试剂：见实验二试剂乙( 又称福林试剂 )。2.0.56M 碳酸钠溶液。3.10三氯乙酸。4.0.02M(pH7.5)磷酸缓冲液。5.0.5干酪素溶液：干酪素 0.5g，以 0.5molL NaOH lml 滴湿，再加少量 0.02M 磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，定容于 100ml，冰箱保存。6.胰蛋白溶液：取酶 0.1g 溶于 0.02M 磷酸缓冲液 100ml，冰箱保存，( 稀释倍数为 1000)。7.标准酪氨酸溶液：称取 100mg 酪氨酸(预先在 1
11、05烘干箱烘至恒重)，加 0.2molL盐酸溶解后定容至 100ml，再用水稀释 5 倍，得到 200ugml 的酪氨酸溶液。二、器材1.试管及试管架.2.吸管量(1、2、5ml)。3.721 型分光光度计。4.电热恒温水浴箱。5.漏斗、滤纸(或离心机)。操作方法一、标推曲线的制作：取标准酪氨酸溶液，配成不同浓度溶液（0、20、40、60、80、100g/ml）,再各取1ml，加 0.55M 碳酸钠 5ml，再加入福林试剂 lml，于 37水浴 15 分钟，在 680mn 波长处比色，测光密度（OD 680)。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸微克数为横坐标，绘制标准曲线。见下表：试管号 酪氨酸 2
12、00 g/ml(ml)水(ml)酪氨酸最终浓度g/ml1 0 10 02 1 9 203 2 8 404 3 7 605 4 6 806 5 5 100二、样品的测定取酶液再稀释 l 倍，各取 1ml 分别置于 0、1、2 号试管中，(0 号试管再加入 3m1 10三氯乙酸) 于 37水浴中预热 35 分钟，加入预热(37 )的干酪素 2ml，准确保温 15 分钟后，加入 10三氯乙酸 3ml(1、2 号管) 三支管过滤除去沉淀，取清液 1ml，加入 0.55M 碳酸钠 5ml，再加入福林试剂 1ml，于 37水浴中显色 15 分钟，在 680nm 波长比色，测OD680，以 0 号管为空白。
13、二、计算：酶活力单位：在 37下每分钟水解 1g 酪氨酵为一个酶活力单位。样品含蛋白酶活力单位= 56FA式中：A据样品 OD680 查标准曲线得到的相应酪氨酸微克数。F酶液的最终稀释倍数。15反应时间(分钟)。注如果生产和科研工作中需要经常测定蛋白酶活力，则可在标准曲线制作好后，求出斜率 K 值，即可直接从下式求出酶活力：蛋白酶活力(单位)：样品 OD680K酶液稀释倍数K 值求法，在标准曲线上取 100g 时光密度值，再用 100 除。实验三 蛋白质分子量测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目的(1)学习 SDSPAGE 测定蛋白质分子量的原理。(2)掌握 SDSPAGE 测定蛋白质分子量的操
14、作方法。原理SDSPAGE 是 PAGE 的一种特殊形式，有关理论参看本书第一部分第八章第五节。 SDS 是带负电荷的阴离子去污剂。用 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量时，蛋白质需经样品溶解液处理。在样品溶解液中含有巯基乙醇及 SDS，各种蛋白质样品在巯基乙醇作用下，还原成单链，再进一步与 SDS 结合形成带大量负电荷的 SDS蛋白质复合物。因此各种蛋白质分子在 SDSPAGE 中，只能按其分子量大小而分离。SDSPAGE 有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式、电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。试剂与器材一、试剂1.标准蛋白质目前国内外均有厂商生
15、产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于 SDSPAGE 测定未知蛋白质分子量。(1) 高分子量标准蛋白试剂盒(Pharmacia 公司产品，表 22.1)。表 22.1 5 种标准蛋白质蛋白质名称 Mt 来源甲状腺球蛋白 669 000 猪甲状腺铁蛋白 440 000 马肺过氧化氢酶 232 000 牛肺乳酸脱氢酶 140 000 牛心血清清蛋白 67 000 牛血清(2) 低分子量标准蛋白试剂盒，中国科学院上海生物化学研究所东风生化试剂厂生产(表 22.2)，每种蛋白含量为 40g。同时加入 200L 样品溶解，经处理后，上样10L(2g) 就能显示出清晰的条带。表 22.2 5 种
16、标准蛋白质蛋白质名称 Mt磷酸化酶 B 94 000牛血清清蛋白 67 000肌动蛋白 43 000磷酸酐 30 000烟草花叶病毒外壳蛋白 17 500(3) 自己配制低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。如买不到标准蛋白质试剂盒时，可参考常用的标准蛋白质及其分子量。从中选择 3 一 5 种蛋白质，如马心细胞色素C(Mr12 500)、牛胰胰凝乳蛋白原 A(Mr 25 000)，猪胃胃蛋白酶(M r35 000)，鸡卵卵清蛋白(Mr 43 000)，牛血清白蛋白 (Mr 67 000)等蛋白，按照每种蛋白 0.5 一 1mg/ mL 样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白
17、质标准液。2 连续体系 SDSPAGE 有关试剂(1) 0.2mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液：取磷酸氢二钠(AR)Na 2HPO42H2O 25.63g 或Na2HPO412H2O 51.58g，再称取磷酸二氢钠(AR) Na2HPO42H2O 7.73g 或NaH2PO42H2O 8.74g，溶于重蒸水中并定容至 1000mL。(2) 样品溶解液：0.01mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液，内含 1SDS，1巯基乙醇、10甘油或 40蔗糖及 0.02溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如表22.3。表 22.3 连续体系样品溶解液配制SDS 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝
18、 0.2mol/L 磷酸盐缓冲液 加重蒸水至最后总体积为100mg 0.1mL 1mL 2mg 0.5mL 10mL如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。(3） 凝胶贮液：称 Acr 30g，Bis 0.8g，加重蒸水至 100mL，过滤后置棕色瓶，4贮存可用 12 个月。(4)凝胶缓冲液：称 SDS 0.2g，加 0.2mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液至 100mL。4贮存，用前，稍加温使 SDS 溶解。(5) 1% TEMED：取 TEMEDl mL，加重蒸水至 100mL，置棕色瓶内 4贮存。(6) 10%过硫酸铵 (AP)：称 AP1g，加重蒸水至 100mL，此
19、液应每周新配，置棕色瓶内，4贮存。(7) 电极缓冲液(0.1SDS，0.1molL pH7.2 磷酸盐缓冲液)：称 SDS 1g，加 500mL 0.2mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至 1000mL。(8) 1琼脂(糖 )：称琼脂(糖 )1g，加 100mL 上述电极缓冲液使其溶解，4贮存。3.不连续体系 SDSPAGE 有关试剂(1) 10(W/V)SDS 溶液：称 5g SDS，加重蒸水至 50mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。SDS 在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。(2) 1%TEMED(V/V)：取 1mL TEMED ，加重蒸水至 l 00mL，
20、置棕色瓶中，4贮存。(3) 10AP(W/V)：称 AP lg，加重蒸水至 10mL。.最好临用前配制。(4) 样品溶解液：内含 1SDS ，1巯基乙醇，40蔗糖或 20甘油，0.02%溴酚蓝， 0.01mol/L pH8.0 TrisHCl 缓冲液。先配制 0.05mol 儿 pH8.0 TrisHCl 缓冲液：称 Tris 0.6g，加入 50mL 重蒸水，再加入约 3mL 1mol/L HCI，调 pH 至 8.0，最后用重蒸水定容至 100mL。 按表 22.4 配制样品溶解液。表 22.4 不连续体系样品溶解液配制*SDS 巯基乙醇 溴酚蓝 蔗糖 0.05mol/LTris-HCl加
21、重蒸水至最后总体积为100mg 0.1mL 2mg 4g 2mL 10mL* 如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。(5) 凝胶贮液30分离胶贮液：配制方法与连续体系相同。称 Acr 30g 及 Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至 100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。10浓缩胶贮液：称 Acr 10g 及 Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至 100mL。过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。(6) 凝胶缓冲液分离胶缓冲液(30molL pH8.9 TrisHCl 缓冲液 )：称 Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加 1mol/L HCI 约 48mL
22、，调 pH 至 8.9，最后加重蒸水定容至 100mL 4贮存。浓缩胶缓冲液(0.5mol/L pH6.7 Tris HCl 缓冲液)：称 Tris 6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加 1mol/L HCl 约 48mL 调 pH 至 6.7。最后用重蒸水定容至 100mL，4贮存。(7) 电极缓冲液(内含 0.1%SDS, 0.05mol/L Tris 0.384mol/L 甘氨酸缓冲液 pH8.3)：称Tris 6.0g，甘氨酸 28.8g，加入 SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至 l 000mL。(8) 1%琼脂(糖)溶液：称琼脂(糖)1g，加电极缓冲液 100mL，加热使其溶解，
23、4贮存，备用。4.固定液取 50甲醇 454mL，冰乙酸 46mL 混匀。5.染色液称考马斯亮蓝 R250 0.125g, 加上述固定液 250mL，过滤后应用。6.脱色液冰乙酸 75mL，甲醇 50mL，加蒸馏水定容至 1000mL。二、器材夹心式垂直板电泳槽凝胶模 (135100l.5mm)，直流稳压电源( 电压 300600V，电流 50100mA)，吸量管(1，5，10mL)，烧杯(15，50，100mL)，细长头的滴管，1mL 注射器及 6 号长针头，微量注射器(10L 或 50L)，水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿（120160mm） 。操作方法一、安装夹心式垂直板电泳槽用细头长滴
24、管吸取已熔化的 l琼脂(糖)溶液，封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂(糖) 溶液时，应防止气泡进入.琼脂(糖) 溶液用连续体系或不连续体系电极缓冲液配制。二、配胶及凝胶板的制备1.配胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于 SDSPAGE 有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表 22.5 和表22.6。表 22.5 SDS 不连续体系凝胶配制配制 20mL 不同浓度分离胶所需各种试剂用量 /mL试剂名称5% 7.5% 10% 15%配制 10mL 浓缩胶所需试剂用量分离胶贮液30%Acr-0.8%Bis3.33 5.00 6.66 1
25、0.002.50 2.50 2.50 2.50 分离胶缓冲液pH8.9 Tris-HCl 3.00浓缩胶贮液10%Acr-0.5%Bis浓缩胶缓冲液 1.25pH6.7 Tris-HCl10%SDS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.101%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 1.00重蒸馏水 11.87 10.20 8.54 5.20 4.60混匀后，置真空干燥器中，抽气 10min10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05表 22.6 SDS连续体系凝胶配制配制 20mL 不同浓度分离胶所需各种试剂用量 /mL试剂名称5% 7.5% 10%凝胶贮
26、液 30%Acr-0.8%Bis 3.33 5.00 6.660.2mol/L pH7.2 磷酸缓冲液内含 0.2%SDS 10.00 10.00 10.001%TEMED 2.00 2.00 2.00重蒸馏水 4.57 2.90 1.23混匀后，置真空干燥器中抽气 10min10%AP 0.10 0.10 0.10电极缓冲液为 0.1mol/L pH7.2 磷酸缓冲液，内含 0.1%SDS2.凝胶板的制备(1)SDS不连续体系凝胶板的制备分离胶的制备：按表 22.5 配制 20mLl0PAA，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm 高，用 1mL 注射器取少许蒸馏水
27、，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约 34mm 高，以进行水封。约 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水。再用滤纸条吸去多余水分。浓缩胶的制备：按表 22.5 配制 10mL3PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约 30min 后凝胶聚合，再放置 2030min。使凝胶“老化” 。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中。应没过短板约 0.5cm 以上。即可准备加样。(2)SDS连续体系凝胶
28、板的制备：按表 22.6 配制 20mL 所需浓度的 PAA，用细长头滴管将分离胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘 0.5cm 处，插入样品槽模板。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加人蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约 30min，凝胶聚合，继续放置 1030min 后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。三、样品的处理与加样1.样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入 200L 样品
29、溶解液。自己配制标准及未知样品，按 0.51mglmL 样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子( 不要塞紧以免加热时迸出)，在 100沸水浴中保温 3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可入在10冰箱保存较长时间，使用前在 100沸水中加热 3min，以除去亚稳态聚合。2.加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为 10 一 15 L(即 2 一 10g 蛋白) 。如样品较稀，加样体积可达 100L。如样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入
30、加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形凝胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。四、电泳分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS 连续系统预电泳采用 30mA，60120min。1.连续系统在电极槽中倒人 0.1SDS pH7.2 0.1molL 磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至 20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至 50mA， 待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边 11.5cm 处，停止电泳，一般需 56h。2.不连续系统在电极槽中倒入 pH8.3 TrisHCl
31、 电极缓冲液，内含 0.1SDS 即可进行电泳。在制备浓 缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏 pH 环境，如需预电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续 SDSPAGE。开始时电流为 10mA 左右，待样品进入分离胶后，改为 2030mA，当染料前沿距硅像胶框底边 l.5cm 时，停止电泳，关闭电源。五、凝胶板剥离与固定电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子橇开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶 板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。六
32、、染色与脱色将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再刚脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。七、绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上。量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，如图22.1所示。按下式计算相对迁移率 mR：图 22.1 样品及标准蛋白在连续SDSPAG 分离示意图样品槽 1,2,4,5 为待测样品，样品槽 3 自（）极至（+）极分别为磷酸化酶 B（94000 ） ，牛血清清蛋白（67000） ，肌动蛋白（43000） ，碳酸酐酶（30000） ，烟草花叶病毒（17500）相对迁移率 mR (cm)端 距
33、 离溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 距 离蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上在出其分子量。注意事项(1)SDS 纯度：在 SDSPAGE 中，需高纯度的 SDS，市售化学纯 SDS 需重结晶一次或两次方可使用.重结晶方法如下：称 20g SDS 放在圆底烧瓶中，加 300mL 无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约 10min，用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明，冷却至室温后，移至20冰箱中过夜。次日
34、用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量20C 预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀 3 次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置 40以下的烘箱中烘干。(2)SDS 与蛋白的结合量：当 SDS 单体浓度在 1mmol/L 时，1g 蛋白质可与 1.4g SDS 结合才能生成 SDS蛋白复合物。巯基乙醇可使蛋白质间的二硫键还原，使 SDS 易与蛋白质结合。样品溶解液中，SDS 的浓度至少比蛋白质的量高 3 倍，低于这个比例，可能影响样品的迁移率，因此，SDS 用量约为样品量 10 倍以上。此外，样品溶解液应采用低离子强度，最高不超过 0.26，以保证在样品溶解液中有较多的 SDS 单体。在处理蛋白质样品时，
35、每次都应在沸水浴中保温 35min，以免有亚稳聚合物存在。(3)凝胶浓度：应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。分子量在 25000200000 的蛋白质选用终浓度为 5的凝胶，分子量在 1000070000 的蛋白质选用终浓度为10的凝胶；分子量在 1000050000 的蛋白选用终浓度为 15的凝胶，在此范围内样品分子量的对数与迁移率呈直线关系。以上各种凝胶浓度其交联度都应是 2.6。标准蛋白质的相对迁移率最好在 0.20.8 之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量
36、，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白等分子量测定差异较大。(4)对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以 1015L 为宜，如样品系较稀的液体状。为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。(5)由于凝胶中含 SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用 25异丙醇 内含 7%乙酸浸泡，并经常换液，直至 SDS 脱尽（约需 2 一 3 天） ，才可按 PAGE 法制备干
37、板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。关闭层析柱出水口，并向柱管内加入约 13 柱容积的洗脱液，然后在搅拌下将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约 2 一 3cm 后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm 处时停止装柱，关闭出水口。接着再通过 2 一 3 倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000(又称蓝色右旋糖，商品名为 Blue dextr
38、an2000)，红色葡聚糖或细胞色素 C 等配成 2mgmL 的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。3. 加样要照顾到浓度与粘度两个方面。分析用量：l 一 2mL/100mL 柱床容积(12) ；制备用量：20 一 30mL100mL 柱床容积。加样方法与一般柱层析相同。夹紧上、下进、出水口夹子，为防止操作压改变，可将塑料管下口抬高至离柱上端约 50cm 处(Sephadex G75，选用 50cm 液柱操作压) ，打开柱上端的塞子或螺丝帽。吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床
39、面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子。使样品溶液流人柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用 1mL 洗脱液冲洗管壁 2 次。最后加入 34mL 洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连(如图 2l.3)。4洗脱洗脱液应与凝胶溶胀所用液体相同。洗脱用的液体有水(多用于分离不带电荷的中性物质)及电解质溶液(多用于分离带电基团的样品)，如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分，也有使用水与有机溶剂的混合液，如水甲醇，水乙醇、水丙酮等为洗脱剂，可以减少吸附，将组
40、分洗下。本实验洗脱用 0.025mol/L 氯化钾02molL 乙酸溶液。洗脱时，打开上、下进、出口夹子，用 0.025mo1/L 氯化钾一 02mol/L 乙酸溶液，以每管 3mL/10min 流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。影响洗脱液流速的因素有：(1)洗脱液加在柱上的压力操作压( 由液面差引起)，一般来说，流速与柱压力差成正比，但对某些种类凝胶加压不能超过一个极限值，否则加大压力，不仅不能增加流速，反而使流速急剧下降，特别是在使用交联度小(W R7.5)的凝胶时要特别注意。为保持层析过程中恒定的压力，可使用恒压瓶。(2)凝胶交联度：交联度大的凝胶(G 10 至 G-50 型)的流速
41、与柱的压力差成正比，与柱长成反比，与柱的直径无关。交联度小的凝胶(G75 至 G200 型)的流速与柱的直径有关，并在一定操作压差下有最大的流速值，操作压见图 21.4。(3)凝胶颗粒大小：颗粒大时，流速较大，但流速大时洗脱峰形常较宽。颗粒小时，流速较慢，分离情况较好。要求在不影响分离效果情况下，尽可能使流速不致太慢，以免用时过长。5. 重装一般地说，一次装柱后，可反复使用，无特殊的“再生”处理，只须在每次层析后用34 倍柱床体积的洗脱液过柱。由于使用过程中，颗粒可能逐步沉积压紧，流速逐渐会减低，使得一次分析用时过多，这时需要将凝胶倒出，重新填装；或用反冲方法，使凝胶松动冲起，再行沉降。有时流
42、速改变是由于凝胶顶部有杂质集聚，则需将混有脏物的凝胶取出，必要时可将上部凝胶搅松后补充部分新胶，经沉集、平衡后即可使用。6. 凝胶的保存方法凝胶用完后，可用以下方法保存。(1)膨胀状态：即在水相中保存。可按注意事项(9)，加人防腐剂或加热灭菌后于低温保存。(2)半收缩状态：用完后用水洗净，然后再用 60一 70乙醇洗，则凝胶体积缩小，于低温保存。(3)干燥状态：用水洗净后，加入含乙醇的水洗，并逐渐加大含醇量，最后用 95%乙醇洗则凝胶脱水收缩，再用乙醚洗去乙醇，抽滤至干，于 60 一 80干燥后保存。这 3 种方法中，以干燥状态保存为最好。二、蛋白质分子量测定根据待测蛋白质的分子量范围选用 S
43、ephadex G-75 或 G100 型凝胶，其颗粒在 40120m，柱管选用直径 1.01.3cm，柱长 90100cm，本实验选用 1.1l00cm 商品层析柱。1. 测定 V0和 Vi将 0.5ml 蓝色葡聚糖2000 和硫酸铵混合液(2mgmL)上柱、洗脱，分别测出 Ve。蓝色葡聚糖的 Ve即为该柱的 V0硫酸铵洗脱体积 Ve减去 V0即为柱的 Vi。蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断，硫酸铵洗脱峰用 Ba(Ac)2 生成沉淀判断。2. 标准曲线的制作按上述方法将 1mL 标准蛋白质混合液上柱，然后用 0.025mol/L 氯化钾0.2mol/L 乙酸溶液诜脱。流速 3mLl0min
44、，3mL/管。用部分收集器收集，核酸蛋白质检测仪 280nm 处检测，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于 280nm 处测定每管光吸收值。以管号或洗脱体积为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(V e)。然后，以蛋白质分子量的对数lgMt为纵坐标，V e为横坐标，作出标准曲线(图 21.5)。为了结果可靠，应以同样条件重复1 一 2 次，取 Ve 的平均值作图。同时根据巳测出的 V0 和 Vi 以及通过测量柱的直径和凝胶柱床高度，计算出的 Vt，分别求出 Kd 和 Kav。Kd ie0Kav 0Vte也可以 Kd 或 Kav 为横坐标， lgMt
45、 为纵坐标作出标准曲线。3. 未知样品分子量的测定完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定 12 次，取其平均值。也可以计算出 Kav,分别由标准曲线查得样品分子量。实验四 植物组织中 DNA 快速提取目的学会从植物组织中快速提取 DNA 的方法。原理植物组织中的核酸成分为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA） ，核酸与蛋白质结合构成核蛋白。脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白在电解溶液中溶解度明显不同，据此可将二者分离。在 0.15M 氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白溶解度最低。而核糖核蛋白溶解在 0.15M 氯化钠溶液中。利用这一点可以使脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白
46、分开。柠檬酸三钠盐可以作为金属离子的络合剂抑制组织中脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用，通常我们用 0.15M氯化钠、0.015M 柠檬酸钠溶液提取 DNA，并把该溶液称之为 SSC 溶液。使用阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS） 。为的是使 DNA 从脱氧核糖核蛋白中解离出来。而蛋白则变性沉淀从而得到纯净的 DNA。试剂和器材一、实验材料黄化植物幼苗二、试剂：（1） 1SSC 溶液（0.15M 氯化钠，0.015M 柠檬酸钠， pH7.0）称取 8.77 克氯化钠，4.41 克柠檬酸三钠用蒸馏水定容至 1000 毫升。（2） 10SSC 溶液（1.5M 氯化钠，0.15M 柠檬酸钠， pH
47、7.0）称取 87.7 克氯化钠，44.1 克柠檬酸三钠用蒸馏水定容至 1000 毫升。（3） 0.1SSC 溶液：1SSC 溶液用蒸馏水稀释 10 倍即成。（4） 提取液0.45M 氯化钠， 0.045M 柠檬酸三钠盐，0.1M 四乙酸乙二胺（EDTA ） ，1%十二烷基硫钠（SDS）：称取 26.31 克氯化钠，13.23 克柠檬酸钠，37.20克 EDTA，10 克 SDS，溶于 800 毫升蒸馏水中，以氢氧化钠 pH 至 7 定容至1000 毫升。（5） 氯仿异戊醇混合液：氯仿（分析纯）：异戊醇（分析纯）24：1（V/V）（6） 5M 高氯酸钠（7） 95%乙醇三、器材：（1） 天平（
48、2） 剪刀（3） 研钵（4） 量筒（5） 三角瓶（6） 离心机（7） 刻度试管（8） 恒温水浴（9） 冰箱（10） 温度计操作方法1 称取室温内萌发的植物幼苗一定量（在 100 克以内不限量） ，剪碎，放在研钵内，加入等量（W/V）的提取缓冲液，剧烈研磨 35 分钟，使其成为浆状物且量体积。2 将这一浆状物转移到一磨口三角瓶中，加入等体积的氯仿异戊醇混合液，塞好瓶塞，剧烈摇动 30 秒钟，以脱去组织蛋白质。3 室温下离心（4000 转/分， 5 分钟） ，形成三层，小心吸取上层含有核酸的水溶液且量体积，弃去中间的细胞碎片，变性蛋白质层及下层的氯仿。4 将收集的核酸水溶液倒入一个在 72水浴中预
49、热的试管中并在 72下继续保温 34 分钟， （不要超过 4 分钟） ，以灭活组织内的 DNA 酶，然后迅速取出试管放在冰水浴中冷却至室温。5 加入 5M 浓度的高氯酸钠溶液(4：1 体积比) 使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1M。6 再次加人等体积的氯仿一异戊醇混合液，并在带塞的三角瓶中摇晃 20 秒钟。7 将此乳浊液在室温下离心(4000 转/分，5 分钟)，收集上层含核酸的水溶液量其体积8 将收集的核酸水溶液置于烧杯内，然后用滴管慢慢加入此水溶液二倍体积的95的预冷的乙醇于水溶液表面上，用玻璃棒轻轻搅拌，此时核酸将迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。9 将沉淀物在烧杯壁上轻轻挤压以除去乙醇，然后溶解在
