1、骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的机制史旦壁星堡塞堕生整鲞篁朔 ChinJRehabilTheoryPractice.January2004,V.110,No.1骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的机制褚倩王亚平傅新巧张苏明?l3?专题?摘要目的探索骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导分化为神经样细胞的机制.方法分离培养大鼠 MSCs,用二甲基亚砜(DSMO)和丁羟茴醚(BHA)诱导分化,检测诱导分化前,预诱导 24h,诱导分化后 6h,24h 和 48h 神经细胞和神经干细胞的特异性标记蛋白的表达.结果诱导分化后,大部分 MSCs 变成双极,多极和锥形,并相互交织成网络结构.
2、巢蛋白(Nestin) 在诱导分化前不表达,在诱导分化后 6h 达到最高,24h 和 48h 逐渐降低.神经元特异性核蛋白(NeuN)在诱导分化前不表达,在诱导分化后 6h 出现表达,24h 和 48h 表达增强.结论 MSCs 经体外诱导先分化为神经干细胞,然后分化为神经元样细胞.关键词 骨髓间充质干细胞;分化;神经元样细胞;神经干细胞Mechanismofdifferentiationofmesenchymalstemcellsintoneuron-likecellsinvitroCHUQian,WANGYaping.FUXinqiao.eta1.DepartmentofNeurology
3、.丁ogJiHospita1.TongjiMedicalSchooloJ,HuazhongUniversityoJ5(ienceandTechnolog3?.W“ha430030.Hubei.ChinaAbstract0bjectiveTostudythemechanismofdifferentiationofmesenchymalstemcells(MSCs)intoneuronlikecellsinvitro.MethodsMSCsofWistarratswereseparatedandcuhured,andtheninducedwithDMSOandBHAinvitro.Thespeci
4、ficmarkingproteinsofneurons,gliaandneura1stemcellsweredetectedbeforepreinduction,at24hafterpreinduction,at6h,24h.and48hafterneuronalinduction.ResultsAftertheinducement.manyMSCsturnedintobipolar,multipolarandtaper.andthenintersectedasnetworkstructure.Nestinwasstrongpositiveat6hafterneurona1induction,
5、anddecreasedat24h.48haftertheinduction.NeuNwaspresentat6hafterneurona1induction,andincreasedat24h,48haftertheinduction.ConclusionMSCscanbeinducedintoneura1stemcells(NSCs)atfirst,andthendifferentiateintoneuron 一 1ikecellsinvitro.Keywordsmesenchyma1stemcells(MSCs):differentiation:neuronlikecells;neura
6、1stemcells(NSCs)中图分类号:R318.5.R329.2 文献标识码:A 文章编号 :10069771(2004)O 卜 13 一O2本文标引格式 褚倩,王亚平.傅新巧,等.骨髓间充质于细胞体外诱导分化为神经样细胞的机制 U_-.中国康复理论与实践.2O04,10(1):1314.骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是成年哺乳动物骨髓中存在的特殊非造血组织干细胞,它具有自我复制能力,并在特定条件下可分化为多种起源组织 l1,包括成骨细胞,成肌细胞,脂肪细胞和神经元等.探索骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的条件和机制,是目前 MSCs 研究的热点.
7、1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 4 周龄 Wistar 大鼠,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供.1.1.2 主要试剂 FicollPaque(Pharmacia 公司),表皮细胞生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(PeproTechEC 公司),二甲基亚砜(DMSO)和丁羟茴醚(BHA)(Sigma 公司),小鼠抗大鼠 NeuN单抗(Chemicon 公司),小鼠抗大鼠 GFAP 单抗和小鼠抗大鼠 CNPase 单抗(NeoMarkers 公司). 小鼠抗大鼠 Nestin 单抗(Pharmingen 公司).1.2 方法基金项目:1.国家自然科学基
8、金资助项目(No.30070825);2.中国博士后科学基金资助项目(No.2002032215).作者单位:430030 湖北武汉市.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科.作者简介:褚倩(1976 一),女.博士生,河南洛阳市人.主要从事骨髓间充质干细胞的研究.通讯作者:张苏明.1.2.1MSCs 的原代培养和传代无菌条件下取 4 周龄 Wistar 大鼠的股骨和胫骨.用 PBS 冲洗骨髓,吹打均匀后离心,沉淀用 aMEM 重悬后叠加到 2 倍体积FicollPaque(P 一 1.077g/L)分离液上.离心后收集单个核细胞层,清洗后用 aMEM20FBS/10ng,mlEGF/2mM
9、L-glutamine 培养基重悬 ,以 10ml 的密度接种培养.57d 后首次换液.以后视细胞生长情况换液.待细胞完全融合后,以 0.25 胰蛋白酶消化传代.1.2.2MSCs 体外诱导分化传至第 1520 代的融合状态的 MSCs 置于预诱导培养基 aMEM/20FBS/10ng/mlbFGF 中培养 24h 后,换用诱导培养基aMEM/2DMSO/200“MBHA.在倒置显微镜下连续观察 MSCs 的形态变化,并取未经诱导分化的MSCs 和诱导后第 3d 的 MSCs 行免疫细胞化学检测.分别取未经诱导分化的 MSCs,预诱导 24h 及诱导 6h,24h 和 48h 的 MSCs 进
10、行 WesternBlot 检测.1.2.3 免疫细胞化学在室温下甲醇固定细胞 1min,0.25TritonX 一 1()()作用 11min,PBS 漂洗后0.5PBS/BSA 孵育 30min 以封闭非特异性抗原 .吸干残液后分别滴加一抗(Nestin1:1000,NeuN1:200,GFAP1:200,CNP1:100).4IC 孵育 16h 后PBS 漂洗 ,经生物素标记的羊抗小鼠二抗(1:250) 室温孵育 1h,辣根过氧化物酶标记亲和素(1:250)室温?14?主鬯星堡箍 10 卷第 1 期 ChinJRehabilTheoryPractice.January2004,Vol10
11、.N.1孵育 1h 后,DAB 显色.1.2.4WesternBlot 细胞用预冷 PBS 冲洗后,加入500/*l 匀浆缓冲液冰上匀浆,将匀浆液 4,10000rpm离心 3Omin.取上清分装为 100/,1/管,加入等体积 2SDS 凝胶加样缓冲液,混匀后沸水浴上加热 10min,上样量为 20l,蛋白含量为 100/*g,电泳,转膜,杂交,显色.2 结果2.1 倒置显微镜下观察细胞形态在倒置显微镜下可见诱导分化前的梭形细胞(中插图 1.1A),在加入预诱导培养基后没有出现明显的形态变化,换用诱导培养基后 1h,胞体开始收缩,出现少数较小的卵圆形或纺锤形细胞.诱导后 24h,约 6O 细
12、胞变成双极形,多极形和锥形,出现类似神经元细胞的形态.诱导后第 3d,可见多数细胞相互交织成网络结构(中插图 1.1B).2.2 免疫细胞化学未经诱导分化的 MSCs 无 NeuN,Nestin,GFAP,CNP 表达 (中插图 1.2A,C).诱导分化后第 3d 的 MSCsNeuN 表达明显增强(中插图1.2B),有 Nestin 表达( 中插图 1.2D),无 GFAP,CNP表达.2.3WesternBlot 中插图 l_3A 显示不同时间点Nestin 的表达,中插图 1.3B 显示不同时间点 NeuN 的表达,其中 l 道为未经诱导分化的 MSCs,2 道为预诱导 24h 的,3
13、道为诱导后 6h 的,4 道为诱导后 24h的,5 道为诱导后 48h 的.可见,在未经诱导分化时和预诱导 24h,无 NeuN 和 Nestin 表达.Nestin 表达在诱导分化后 6h 呈强阳性,在诱导分化后 24h 和 48h逐渐减弱(中插图 1.3A).NeuN 在诱导分化后 6h 有表达,在诱导分化后 24h 和 48h 表达增强(中插图 1.3B).3 讨论骨髓间充质干细胞因易于取材,避免了神经于细胞和胚胎干细胞移植所带来的伦理学问题;同时,它在体外培养时扩增迅速,自体移植后没有免疫排斥反应.这些优点使其成为极有前景的神经移植材料.目前,有关在体外培养条件下诱导 MSCs 已有报
14、道口-.有学者提出 MSCs 转变为具有神经细胞标记蛋白的细胞不是因为其自身的分化潜能,而是细胞融合所致.然而细胞融合学说存在严重缺陷.首先,细胞融合在自然界中发生率仅为 10,而我们观察到约 60MSCs 转变为神经元样细胞,Woodbury 和Deng 观察到的比例分别为 80_和 25 一.其次,MSCs 仅在有 IL 一 3 存在时才能发生融合,而在以上实验中均未使用 IL 一 3.同时,Mezey 等在多例尸检中发现,在接受男性供体骨髓移植的女性患者脑内可见到 Y 染色体阳性细胞成簇出现.其中含有神经元,少突胶质细胞,星形胶质细胞和小胶质细胞等多种成分.结合本实验结果,MSCs 转变
15、为神经样细胞是由其自身多向分化潜能决定的.MSCs 定向诱导分化为神经元的机制尚无定论.众所周知,神经元和神经胶质细胞是由神经干细胞分化而来,Nestin 是神经干细胞的标记蛋白.NeuN 是细胞从神经细胞分化的共同通路中脱离出来.终末分化为神经元的起始标志.本实验结果显示:不具有Nestin 和 NeuN 表达的 MSCs,在诱导分化后表达了这两种特异性蛋白.同时提示,在诱导分化的早期,细胞以神经干细胞表型为主,在诱导分化的 24h 和 48h以神经元表型为主,说明 MSCs 先分化为神经干细胞,再向神经元分化.研究表明,未经诱导分化的 MSCs同时具有内,中,外 3 个胚层的特异性基因,在
16、特定条件下,可以通过这些基因表达的定量调节而实现神经系统的定向分化.由于 MSCs 是骨髓中除造血干细胞以外的多种干细胞成分的组合.推测其中存在神经干细胞的前体细胞.本研究结果显示,碱性成纤维细胞生长因子,二甲基亚砜和丁羟茴醚可定向诱导 MSCs 先分化为神经干细胞,再进一步分化为神经元样细胞.但定向分化出的神经元是否具有突触功能和电生理特性,尚有待于进一步深入研究.参考文献1PittengerMF.MackayAM.BeckSC.eta1.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells-J:.Science.1999.284:143
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