1、1 目的 建立洁净度（沉降菌）的检验标准操作规程，为沉降菌检查人员提供正确的标准操作方法。2 范围适用于本公司洁净度（沉降菌）检查的全过程。3 责任QA 对本规程的有效执行承担监督检查责任，QC 对本规程的实施负责。4 程序4.1 概述：本标准对尘粒及微生物污染规定需进行环境控制的房间或区域。其建筑结构、装备及其使用均具有减少对该区域内污染源的介入、产生和滞留的功能。4.2 测试方法4.2.1 方法提要：本标准按国家技术监督局发布的医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法 ，采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以
2、平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。4.2.2 仪器仪器包括：培养皿、培养基、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器。4.2.2.1 培养皿一般采用 90mm15mm 规格的培养皿。4.2.2.2 培养基大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或用户认可并经验证了的培养基。4.3 测试前的规则：4.3.1 测试状态；4.3.1.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时，温度在 1826，相对湿度在 45%65%之
3、间为宜） ，同时应满足测试仪器的使用范围。4.3.1.2 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。4.3.1.3 测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。4.3.1.4 静态测试时，培养皿暴露时间为 30min 以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于 4h。4.3.2 测试人员：4.3.2.1 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。4.3.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于 2 人。4.3.3 测试时间：4.3.3.1 对单向流，如 100 级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于 10min 后开始。4.3.3.
4、2 对非单向流，如 B 级、B 级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于 30min 后开始。4.3.4 注意事项：4.3.4.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。4.3.4.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。4.3.4.3 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。4.3.4.4 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。4.3.4.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。4.3.4.6 对于单向流洁净室（区）
5、或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区） ，采样口向上。4.3.4.7 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口；采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。4.3.4.8 培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取 1 个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿（TSA 或 SDA）一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。4.4 测试步骤：4.4.1 采样方法：4.4.1.1 仪器和用具：培养皿。4.4.1.2 方法：a 采样点一般在离地面 0.8m 高度的水平面上均匀布置。b 采
6、样点多于 5 点时，也可以在离地面 0.8m1.5m 高度的区域内分层布置，但每层不少于 5 点。c 打开培养皿盖，使培养基表面暴露 0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。最少采样点数目洁 净 度 级 别 洁 净 度 级 别面 积（m 2） A B B面 积（m 2） A B B10 23 2 2 200400 80 20 61020 4 2 2 4001000 160 40 132040 8 2 2 10002000 400 100 3240100 16 4 2 2000 800 200 63100200 40 10 3注：表中的面积，对于单向流洁净室，是指送风口面积。对于非单向流洁净室是指房间
7、的面积。最少培养皿数洁净度级别 所需 90mm 培养皿数（沉降 0.5h 计）A 14B 2C 2D 24.4.2 培养：4.4.2.1 仪器和用具：培养箱、天平（万分之一） 、称量纸、锥形瓶（1000ml、150ml） 、量筒（1000ml） 、高压蒸汽灭菌锅。4.4.2.2 培养基：4.4.2.2.1 大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）：a） 成分：酪蛋白胰酶消化物 15g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 5g 氯化钠 5g 琼脂 15g 纯化水 1000mlb） 制法：取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节 pH 值使灭菌后为7.30.2，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷却至约 60，在无菌操作
8、要求下倾注约 20ml 至无菌平皿（90mm）中。加盖后在室温放至凝固。4.4.2.2.2 沙氏培养基（SDA）：a）葡萄糖 40g 酪蛋白胰酶消化物、动物组织的胃酶消化物等量混合 10g 琼脂 15g 纯化水 1000mlb）制法：取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节 pH 值使灭菌后为5.60.2，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷却至约 60，在无菌操作要求下倾注约 20ml 至无菌平皿（90mm）中。加盖后在室温放至凝固。4.4.2.3 方法：全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养，采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿在 3035培养箱中培养，时间不少于 2天；采
9、用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿在 2025培养箱中培养，时间不少于 5 天。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定 3 只培养皿作对照培养。4.4.3 菌落计数：4.4.3.1 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用 510 倍放大镜检查，有否遗漏。4.4.3.2 若培养皿上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠，可分辨时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。4.4.4 结果计算：4.4.4.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数。4.4.4.2 平均菌落数的计算，见式。M1+M2+Mn 平均菌落数 M= n式中 M平均菌落数；M11 号培养皿菌落数；M22 号培养皿菌落数；Mnn 号培养皿菌落数；n培养皿总数。4.4.5 结果评定：用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。4.4.5.1 洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。4.4.5.2 在静态测试时，若某洁净室（区）内的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
