1、乳铁蛋白结合聚乙二醇聚乳酸纳米粒脑内递药特性的体内外研究胡凯莉，李靖炜，沈烨虹, 陆伟，高小玲 , 蒋新国 *（复旦大学药学院药剂教研室，上海 200032）摘要：目的 构建一种新型可生物降解脑内递药系统 -乳铁蛋白结合聚乙二醇聚乳酸纳米粒（Lf-NP ） ，并对其脑内递药特性进行体内外评价。 方法 采用马来酰亚胺基聚乙二醇- 聚乳酸和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸通过复乳溶剂挥发法制备纳米粒（NP）,将其与巯基化的乳铁蛋白（Lf）共价连接制得 Lf-NP。采用透射电镜技术，免疫电镜技术，动态光散射分析，X-射线光电子能谱分析及酶联免疫吸附试验对 Lf-NP 的形态 ,粒径和表面 Lf 的连接进行鉴定
2、和表征。以香豆素-6 为荧光探针定性及定量的研究了小鼠脑毛细血管内皮细胞 bEnd.3对 Lf-NP 的摄取情况。采用 CCK-8 评价了 Lf-NP 对细胞活力的影响。利用荧光显微技术和冷冻切片技术观察小鼠尾静脉注射载香豆素-6 的 Lf-NP 后的脑内分布情况并进行了药动学研究。 结果 制得的 Lf-NP 形态圆整，粒径在 110 nm 左右。免疫电镜技术，X- 射线光电子能谱分析及酶联免疫吸附试验证实了 Lf-NP 表面共价连接有 Lf，且每个 Lf-NP 表面的 Lf数约为 55。bEnd.3 对 Lf-NP 的摄取在 37，不同浓度和不同孵育时间条件下均显著高于未结合纳米粒（NP）
3、。静脉注射载香豆素-6 的纳米粒后，Lf-NP 组小鼠脑内香豆素-6 的量约为 NP 组的 3 倍。3 mg/ml 的 Lf-NP 对 bEnd.3 细胞的活力无显著影响。 结论 Lf-NP 能显著增加药物的脑内递送且具有较好的生物相容性，有望作为一种新型的脑内递送系统输送蛋白多肽和基因等大分子药物入脑。关键词：乳铁蛋白；血脑屏障；香豆素-6；生物可降解纳米粒；脑内递送中图分类号：R9 基金项目：国家 973 项目“导向性纳米载药系统及其脑部疾病治疗与诊断中的应用基础研究”作者简介：胡凯莉，女，博士研究生 *通讯作者：蒋新国，男，研究员，博士生导师 Tel: (021)54237381 E-m
4、ail: Lactoferrin-conjugated PEGPLA nanoparticles with improved brain delivery: in vitro and in vivo evaluationsHU Kai-li, LI Jing-wei, SHEN Ye-hong, LU Wei, GAO Xiao-ling, Jiang Xin-guo (Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032)ABSTRACT：OBJECTIVE To construc
5、t the lactoferrin (Lf) conjugated poly (ethyleneglycol) poly (lactide) (PEGPLA) nanoparticle (LfNP) as a novel biodegradable brain drug delivery system and evaluate its in vitro and in vivo delivery properties. METHODS Lf was thiolated and conjugated to the distal maleimide functions surrounding on
6、the pegylated nanoparticles prepared by double emulsion and solvent evaporation procedure to form the LfNP. Dynamic light scattering analysis, transmission electron micrograph (TEM), X-ray photoelectron spectrometry analysis and ELISA were used to characterize the Lf-NP. A fluorescent probe, coumari
7、n-6 was incorporated into LfNP and its uptake by a mouse brain capillary endothelial cell line, bEnd.3 were compared to that of unconjugated nanoparticle (NP). The brain distribution of Lf-NP following an intravenous administration was evaluated quantitatively by pharmacokinetic studies and qualitat
8、ively by fluorescent microscopy. The influence of Lf-NP on cell viability was also evaluated. RESULTS Dynamic light scattering analysis and transmission electron micrograph (TEM) showed that the LfNP had a round and regular shape with an average diameter of around 110 nm. The existence of Lf on the
9、surface of LfNP was verified by TEM observation and X-ray photoelectron spectrometry analysis. The Lf ELISA results confirmed the biorecognitive activity of Lf after the covalent coupling procedure and suggested the average number of Lf conjugated on each nanoparticle was around 55. The uptake of Lf
10、NP by bEnd.3 was shown significantly higher than that of NP at 37 , at different concentrations and incubation times. Following an intravenous administration of a dose of 60mg/kg in mice caudal vein, a near 3 folds of coumarin-6 were found in the mice brain carried by LfNP compared to that carried b
11、y NP. Cell viability experiment results confirmed good safety of the biodegradable LfNP. CONCLUSION The significant in vitro and in vivo results suggested that LfNP is a promising brain drug delivery system with low toxicity.KEY WORDS: Lactoferrin; Bloodbrain barrier (BBB); Coumarin-6; Biodegradable
12、 nanoparticle; Brain delivery血脑屏障（BBB）在保护中枢神经系统免受外源性毒物损伤的同时也限制了大多数神经治疗药物入脑，成为脑部疾病治疗的最大障碍1。大约98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物，包括酶，基因和siRNAs等均不能透过BBB2。随着现今脑部疾病发病率的不断升高，通过各种给药系统和靶向策略增加药物的脑内传递已成为解决这一问题的关键。局部侵入给药（脑内直接注射/滴注）易引发感染，手术费用高且有效递药面积有限3。而非侵入给药借助BBB上存在的内源性物质转运系统可以避免破坏血脑屏障并实现广泛的全脑递药4。在各种非侵入给药方式中，利用在BBB上存在特异受
13、体的靶向头基连接载药系统得到的受体介导的脑内递药系统在具有脑靶向功能的同时能够提高药物包封率，降低副作用和避免多药耐药系统的外排，具有很好的前景5 。目前最具代表性的受体介导脑内递药系统OX26结合的免疫脂质体成功用于小分子药物及基因药物的脑内递送，证实了受体介导途径优良的脑内递药能力6, 7。然而，脂质体的稳定性差及单克隆抗体效果的不稳定限制了其进一步应用8-10。因此，脑部疾病的治疗仍需开发新型的脑内递药系统。乳铁蛋白是一种阳离子铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，它由690个氨基酸折叠而成两个球形裂片，各包含一个铁结合位点。Lf具有抗炎，免疫调节，抗菌及抗癌等多种生理功能11。现已证明多种生
14、物BBB表面均存在Lf受体（LfR），能够介导Lf 转运 12-14。最近, Ji等人比较了Tf，OX-26和Lf的入脑性能，结果证实Lf 的入脑能力显著高于前两者 15。本试验利用Lf 的脑靶向能力构建了受体介导的生物可降解脑内递药系统并探索了Lf 作为脑靶向头基的能力。采用聚乙二醇- 聚乳酸纳米粒与Lf连接是基于纳米粒相对于脂质体的诸多优点：具有较好的稳定性，处方中辅料种类较少，制备相对简单，具有一定的缓释能力便于慢性疾病的治疗16。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA 已批准的辅料，将使载药系统具有较好的生物相容性和安全性17，18。为了评价其脑内递药特性，以香豆素-6为荧光探针定性和定量地
15、研究了小鼠脑毛细血管内皮细胞对Lf-NP和 NP的摄取及它们在小鼠脑内的分布,并通过细胞活力试验进行了该系统体外毒性的评价。1. 仪器和材料JY92-II 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司） ；R-200 旋转蒸发仪和 B-490 恒温水浴（Buchi，德国） ； NICOMPTM 380 ZLS 粒度/zeta电位测定仪（NICOMP ，美国） ；PHI 5000C X 射线光电子能谱仪（ESCA system，美国） ；CM 120 透射电镜（Philip，荷兰） ；CO 2 培养箱（Heraeus ，中国香港） ；UFX-DX 倒置相差显微镜（Nikon，日本） ；UFX-
16、II 荧光显微镜（Nikon，日本） ；LC-10A RF-10AXL 高效液相色谱仪（Shimadzu，日本） 。乳铁蛋白（Sigma, 美国） ；MPEG（M r 3000，SUNBRIGHTTM MEH-30H，NOF，日本） ；Maleimide-PEG （M r 3400，NEKTAR ，美国） ；Trauts 试剂（Sigma，美国） ；山羊抗 Lf 抗体（Bethyl，美国） ；10 nm 胶体金标记兔抗山羊 IgG 抗体（ Sigma，美国） ；Lf ELISA 试剂盒（Bethyl ，美国） ；HiTrap 脱盐柱（Amersham Pharmacia Biotech AB，
17、瑞典） ；DMEM 培养液和胎牛血清（Gibco，美国） ；荧光封片剂（ Dako，美国） ；香豆素-6（Aldrich，德国） ；CCK-8（Dojindo Laboratories，日本） ； BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海申能博彩公司，中国） ；昆明鼠（18-20 g，复旦大学实验动物部） 。2. 实验方法2.1 NP 和 Lf-NP 的制备及表征马来酰亚胺基聚乙二醇-聚乳酸和甲氧基聚乙二醇-聚乳酸 1：9 混合以复乳溶剂挥发法制备 NP 19。Lf 与 Trauts 试剂 1： 40 反应后以 HiTrap 脱盐柱进行纯化。巯基化 Lf 与 NP 常温下反应 9h 制得 Lf-NP。
18、成初乳前有机相中加入香豆素-6 ，制备载香豆素-6 的 NP 和 Lf-NP，以 Sepharose CL-4B 除去未包封的香豆素-6 。采用透射电镜技术（TEM）和动态光散射分析（DLS）对 Lf-NP 和 NP的形态，粒径进行表征。以免疫电镜技术和 X-射线光电子能谱对 Lf-NP 表面连接的 Lf 进行验证。 ELISA 测定 Lf-NP 表面 Lf 个数。考察载香豆素-6 的 Lf-NP和 NP 在 pH 4.0 和 pH 7.0 两种介质中 24h 的体外释放情况。2.2 Lf-NP 脑内递药特性和生物相容性的体外评价小鼠脑毛细血管内皮细胞 bEnd.3 以 104/cm2 密度接
19、种于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，置于 24 孔培养板中培养 1 天。细胞用 HBSS 预先孵育 15 min 后，分别加入载香豆素-6 Lf-NP 和 NP 的 HBSS 溶液（15 g/ml） ，37分别孵育 0.5 h、1 h 和 2 h。弃去纳米粒溶液，细胞用 PBS 冲洗三次，取出玻片放入 4%多聚甲醛中于室温固定 20 min，用 PBS 漂洗 3 次后，用荧光封片剂封片，用相差及荧光显微镜观察。bEnd.3 以 105/cm2 接种于 24 孔培养板中培养 1 天。将载有香豆素-6 的 Lf-NP 和 NP 稀释成含 160 g/ml 的纳米粒供试液，按不同浓度每孔加入 1 ml（空
20、白孔加 1 ml HBSS） ，分别放入 37及 4孵育 1 h，考察细胞在 4和37下对 Lf-NP 和 NP 的摄取情况。同时将载香豆素-6 的 Lf-NP 和 NP 分别以10 g/ml 的浓度加入培养孔中，放入 37培养箱孵育 0.25、0.5、1、2 和 4 h，考察在 37下、不同时间内 bEnd.3 对 Lf-NP 和 NP 的摄取情况。加入 10 g/ml Lf-NP 和过量 Lf（10 mg/ml ）37 孵育 30min 进行摄取抑制试验。试验结束后，弃去纳米粒溶液，细胞用 1 ml 冰冷的 PBS 终止摄取，再用 PBS 1ml 冲洗 5 次。用 1% Triton-X
21、100 400 l 溶解细胞。采用 HPLC 法测定溶解液中香豆素-6 的浓度，以 BCA 法测定蛋白浓度。bEnd.3 以每孔 5104 个细胞的密度接种于 96 孔培养板中培养过夜。分别加入样品浓度为 03.0 mg/ml 的 Lf、NP 和 Lf-NP 的 PBS 溶液，37 孵育 4 h，溶液用 110 l 新鲜的培养液（含 CCK-8 10 l）替换，37孵育 4 h。用酶标仪在 450 nm 处读数。以培养液为对照，计算细胞活力。2.3 Lf-NP 脑内递药特性的体内评价小鼠尾静脉注射 60 mg/kg 载香豆素-6 的 NP 和 Lf-NP， 1h 后乙醚麻醉，心室灌注生理盐水
22、20 min， ，断头处死，取脑置 4%多聚甲醛固定 24h，蔗糖梯度脱水后于视交叉后 1 cm 处冠状切脑组织，O.C.T.包埋，冰冻切片，厚度 20 m，PBS 漂洗后用 1 g/ml DAPI 染色 10 min，PBS 漂洗，用荧光封片剂封片，荧光显微镜观察纳米粒在脑组织中的分布和荧光强度。54 只小鼠平均分成 2 组，每组分别尾静脉注射载香豆素-6 的 Lf-NP 和 NP溶液（载药量分别为 0.69%和 0. 71%） 60 mg/kg，于给药后的0.083，0.25，0.5，1，2，4，8，12 和 24 h 摘眼球取血后处死，迅速取出大脑去除脑膜上的血管，称重后-20保存。每个
23、时间点重复采集 3 只小鼠样品。样品处理后以 HPLC 法分析血中和脑中的香豆素 -6 含量。将各样品的峰面积比代入相应的标准曲线求得脑组织及血样中的药物浓度。由各时间点三个样本的平均药物浓度经剂量校正后对相应的时间作图，得药时曲线，梯形法计算药时曲线下面积（AUC 0-t） 。以 SPSS 软件进行统计学分析。3. 结果3.1 NP 和 Lf-NP 的表征透射电镜下观察，制得的 NP 和 Lf-NP 大小均匀、外观圆整，粒径分别为（91.7 8.76）nm 和（108.6 11.5）nm。XPS 测得其表面 N 元素含量为0.24%；透射电镜下可以清楚的观察到，Lf-NP 表面标记有黑色的胶
24、体金颗粒（图 1C） ，而未加入山羊抗 Lf 抗体孵育的 Lf-NP（图 1D）和 NP 表面（图1E）未见胶体金颗粒，证实该纳米粒表面连接有 Lf。ELISA 测得每个 Lf-NP 表面约有（5513）个 Lf。体外释放实验结果表明载香豆素-6 的 Lf-NP 和 NP 在pH 4.0 和 pH 7.0 两种介质中 24h 内的累积释放均不超过 6%，因此，香豆素-6可以作为荧光探针示踪纳米粒。图 1 纳米粒的透射电子显微镜照片，标尺均为 100 nmA-NP；B-Lf-NP ；C-加入抗 Lf 一抗和连接有 10nm 胶体金兔抗羊 IgG 二抗后的 Lf-NP；D-仅加入连接有 10nm
25、胶体金兔抗羊 IgG 二抗的 Lf-NP；E-加入抗 Lf 一抗和连接有 10nm 胶体金兔抗羊 IgG 二抗后的 NPFig. 1 Transmission electron micrograph of different nanoparticles negatively stained with phosphotungstic acid solution. Bar on each photo was 100 nm.A- NP; B- LfNP; C- LfNP stained with anti-Lf primary antibody and 10nm colloidal gold lab
26、eled rabbit anti-goat IgG sequentially; D- LfNP only stained with 10nm colloidal gold labeled rabbit anti-goat IgG; E- NP stained with anti-Lf primary antibody and 10nm colloidal gold labeled rabbit anti-goat IgG sequentially. 3.2 Lf-NP 脑内递药特性和生物相容性的体外评价bEnd.3 对 NP 和 Lf-NP 的摄取呈时间依赖性，各时间点 Lf-NP 的摄取量均
27、高于 NP，4h 时 Lf-NP 的摄取量约为 NP 的 1.45 倍。 两种纳米粒 37 C 的摄取量均高于 4 C，呈温度依赖性（图 2A）。37 C 时，两种纳米粒摄取量随浓度的升高呈线性升高（图 2A），具有浓度依赖性，在 60 g/ml 时，Lf-NP 的摄取量为 NP 的 1.47 倍。4 时，两种纳米粒的摄取很快达到饱和，未见有显著差异。两种纳米粒的摄取呈时间，温度和浓度依赖性，为主动内吞过程。Lf-NP的摄取量高于 NP，提示由于 Lf 的引入 Lf-NP 可能存在不同于 NP 的内吞机理。摄取抑制实验结果表明，加入过量的 Lf 后（10 mg/ml）后，Lf-NP 的摄取被抑
28、制到与 NP 相近的水平，证实了 Lf-NP 能够通过 Lf 介导的内吞方式被摄取。由荧光显微镜照片可看出，在 37 C，给予相同浓度的 Lf-NP 和 NP 后， 细胞内的荧光强度随着时间的推移而增强，在 30min，1h 和 2h， Lf-NP 组的荧光均显著强于 NP 组。2h 后，Lf-NP 广泛分布在整个细胞且进入细胞核（图 3H）而NP 则主要分布于胞浆。Lf，Lf-NP 和 NP 的 CCK-8 试验结果表明，与 Lf 及 NP 相似，Lf-NP 对细胞活力无显著影响，在给予 Lf-NP 3mg/ml 后细胞活力依然大于 80%（图 4） 。图 2 bEnd.3 摄取试验和摄取抑
29、制试验结果， n=3， *p0.05A-1-60 g/ml LfNP和NP 分别在 37 C和4 C孵育1h后的摄取情况；B-10 g/ml LfNP和NP在37 C孵育不同时间后的摄取情况；C-10 g/ml NP, LfNP和加入10 mg/ml Lf的LfNP在37 C孵育 30 min后的摄取情况Fig. 2 bEnd.3 uptake quantitative results, n=3 *p0.05 A- 1-60 g/ml LfNP and NP at 37 C and 4 C incubation for 1h, respectively; B- 10 g/ml LfNP and
30、 NP at 37 C incubation for different time; C- 10 g/ml NP, LfNP and LfNP with 10 mg/ml Lf at 37 C incubation for 30 min 图 3 37 C bEnd.3 摄取 15 g/ml Lf-NP 和 NP 的荧光显微镜照片， G 和 H 中标尺为 50 m，其余标尺为 100 mA/I- NP 孵育 0.5 h；D/L- Lf-NP 孵育 0.5 h；B/J- NP 孵育 1 h；E/M- Lf-NP 孵育 1 h；C/K- NP 孵育 2 h；F/N- Lf-NP 孵育 2 hFig.
31、 3 Fluorescent microscopy photographs of bEnd.3 cells exposed to 15 g/ml LfNP and NP at 37 C. The magnification bar is 100 m. Inserts G and H are of greater magnification. The magnification bar is 50 m.A/I- NP incubation for 0.5 h；D/L- Lf-NP incubation for 0.5 h；B/J- NP incubation for 1 h；E/M- Lf-NP
32、 incubation for 1 h；C/K- NP incubation for 2 h；F/N- Lf-NP incubation for 2 h图 4 NP, LfNP 和 Lf 的体外毒性评价，n=3Fig. 4 In vitro cytotoxicity of NP, LfNP and Lf on bEnd.3 cells at concentrations ranging from 0.025 to 3 mg/ml. Data represented the mean S.D. n=3.3.3 Lf-NP 脑内递药特性的体内评价小鼠大脑冰冻切片的荧光显微镜观察结果表明在第三脑室室
33、周区，皮层和纹状体（图 5B, D 和 F）Lf-NP 的分布显著高于 NP (图 5A, C 和 E)。这说明Lf-NP 通过不同于 NP 的机理转运入脑。Lf-NP 特定的浓集于纹状体和第三脑室室周区，这一特点可以用于治疗帕金森病，肥胖等靶点位于此部位的疾病。通过测定香豆素-6 在血和脑中的浓度评价两种纳米粒在血和脑中的分布，结果表明，两种纳米粒在脑内的药时曲线相似，约在 1h 时达峰（图 6） ，Lf-NP脑内的 AUC(0t)约为 NP 的 2.98 倍。Lf 的引入增加了纳米粒在脑内的浓集，这可能是连接在表面的 Lf 通过其在 BBB 上的主动转运增加了纳米粒入脑。给予Lf-NP 和
34、 NP 后，血中的香豆素-6 浓度没有显著差异，说明少量 Lf 连接在纳米粒表面并不影响 PEG 的长循环功能。图 5 尾静脉注射 60 mg/kg Lf-NP 和 NP1h 后的脑内分布，标尺为 50 mA-给予 NP 后的第三脑室室周区；B- 给予 Lf-NP 后的第三脑室室周区；C- 给予 NP 后的大脑皮质；D- 给予 Lf-NP 后的大脑皮质； E- 给予 NP 后的纹状体区域；F-给予 Lf-NP 后的纹状体区域Fig. 5 Distribution of NP and LfNP in mouse brain after i.v. 60 mg/kg nanoparticles in
35、 mouse caudal vein, visualized using the FITC filter 1h. The magnification bar is 50 m.A- periventricular region of the third ventricle after NP administration; B- periventricular region of the third ventricle after Lf-NP administration; C- cortex after NP administration; D- cortex after Lf-NP admin
36、istration; E- striatum region after NP administration F- striatum region after Lf-NP administration图 6 小鼠尾静脉注射 60 mg/kg 纳米粒后血和脑中的香豆素-6 的药时曲线，n=3Fig. 6 Blood and brain concentration-time profiles of coumarin-6 following i.v. injection of coumarin-6 loaded LfNP and NP at a dose of 60 mg/kg in mice. n=
37、3.4. 讨论粒径大小直接影响微粒系统被脑毛细血管内皮细胞内吞的能力，通常用于脑内递药的纳米粒和脂质体的粒径都在 200nm 以下。本文采用 Lf 构建的新型生物可降解脑内递药系统 Lf-NP 粒径在 150nm 以下，适宜用于脑内递药。作为受体介导的脑内递药系统，靶向头基的成功连接是保证系统脑靶向性能的关键，因此我们通过多种方法证实了 Lf 在 Lf-NP 表面的成功连接。bEnd.3 是一种小鼠脑毛细血管内皮细胞株,它具有多种内皮细胞的性质 :表达 von Willebrand 因子,具有血管内皮生长因子受体并可以内吞乙酰化的低密度脂蛋白等20 。它生长迅速，多次传代后仍能够保持血脑屏障的
38、性质，形成功能性屏障且易于进行多种分子生物学干涉，适宜作为血脑屏障的模型21。因此，我们选用 bEnd.3 作为 BBB 模型进行 Lf-NP 脑内递药特性的体外研究。文献报道载香豆素-6 的 PLGA 纳米粒与细胞孵育 2h 后，游离香豆素-6 仅占细胞摄取香豆素-6 总量的 3%22，我们进行的体外泄露试验也证实了 24h 内香豆素-6 主要位于纳米粒内部。因此，我们认为测得细胞中的香豆素-6 主要反应了包载其的纳米粒的分布情况。Garr 的研究表明被 K562 髓性白血病细胞摄取后的 Lf 可以进入细胞核并与 DNA 结合，Nuijens 等人的研究也表明 Lf 可能具有调节基因表达的功
39、能，这与我们观察到 Lf-NP 在细胞核中的分布相一致。Lf 的这种进入细胞核的能力可能会利于基因药物的递送。有文献报道在某些病理条件下（如帕金森病和 Alzheimers 病）Lf 受体在脑内的表达量会增加23-25 ，虽然这种现象的机理还没有明确，我们却可以借助 Lf 的这种性质利用 Lf-NP 更好的治疗这些疾病在进行新型药物传递系统开发过程中，一个非常重要的方面就评价其生物相容性和对于靶细胞的毒性，对于脑内递药系统更是如此。PLA 是一种公认的低毒，生物相容且可降解的聚合物，被广泛用于植入剂26, 27。此外，PEG 的毒性也很低28 。因此，NP 可以作为安全的对照组。临床研究证实了
40、 Lf 的安全性29, 30。统计学分析的结果表明，给予 NP，Lf 和 Lf-NP 后，各组细胞活力无显著差异，体外证实了 Lf-NP 良好的安全性。然而，其体内毒性和长期毒性还有待进一步考察。致谢：感谢第二军医大学药学院的芮耀成老师提供了 bEnd.3 细胞株。感谢复旦大学的赵慧玲老师和戴维林老师指导进行了 TEM 和 XPS 的分析。REFERENCES1 PARDRIDGE W M. Bloodbrain barrier delivery J. Drug Discov Today, 2007, 12(1/2):54-61.2 PARDRIDGE W M. Drug targeting
41、to the brain J. Pharm Res, 2007, 24(9): 1733-1744.3 GARCIA-GARCIA E, ANDRIEUX K, GILB S, et al. Colloidal carriers and bloodbrain barrier (BBB) translocation: a way to deliver drugs to the brain? J. Int J Pharm, 2005, 298: 274-292.4 DE BOER A G, GAILLARD P J. Strategies to improve drug delivery acro
42、ss the blood-brain barrier J. Clin Pharmacokinet, 2007, 46(7):553-576.5 CALVO P, GOURITIN B, CHACUN H, et al. Long-circulating PEGylated polycyanoacrylate nanoparticles as new drug carrier for brain delivery J. Pharm Res, 2001, 18:1157-1166.6 HUWYLER J, WU D F, PARDRIDGE W M. Brain drug delivery of
43、small molecules using immunoliposomes J. P Natl Acad Sci USA, 1996, 93(24):14164-14169.7 ZHANG Y, CALON F, ZHU C, et al. Intravenous nonviral gene therapy causes normalization of striatal tyrosine hydroxylase and reversal of motor impairment in experimental parkinsonism J. Hum Gene Ther, 2003, 14(1)
44、:1-12.8 SHARMA A, SHARMA U. Liposomes in drug delivery: progress and limitations J Int J Pharm, 1997, 154:123-140.9 MOOS T, Morgan E H. Restricted transport of anti-transferrin receptor antibody (OX26) through the blood-brain barrier in the rat J. J Neurochem, 2001, 79(1):119-129.10 GOSK S, VERMEHRE
45、N C, STORM G, et al. Targeting anti-transferrin receptor antibody (OX26) and OX26-conjugated liposomes to brain capillary endothelial cells using in situ perfusion J. Cerebr Blood F Met, 2004, 24(11):1193-1204. 11 NUIJENS J H, VAN BERKEL P H C, SCHANBACHER F L. Structure and biological actions of la
46、ctoferrin J. Mammar Gland Biol, 1996, 1(3):285-295.12 FILLEBEEN C, DESCAMPS L, DEHOUCK M P, et al. Receptor-mediated transcytosis of lactoferrin through the blood-brain barrier J. J Biol Chem, 1999, 274(11):7011-7017.13 SUZUKI Y A, LOPEZ V, LNNERDAL B. Mammalian lactoferrin receptors: structure and
47、function J. Cell Mol Life Sci, 2005, (62):2560-2575.14 HUANG R Q, KE W L, QU Y H, et al. Characterization of lactoferrin receptor in brain endothelial capillary cells and mouse brain J. J Biomed Sci, 2007, 14:121-128.15 JI B, MAEDA J, HIGUCHI M. Pharmacokinetics and brain uptake of lactoferrin in ra
48、ts J. Life Sci, 2006, 78:851-855.16 OLIVIER J C. Drug transport to brain with targeted nanoparticles J. NeuroRx, 2005, 2:108-119.17 LANGER R. Tissue engineering: a new field and its challenges J. Pharm Res, 1997, 14 (7):840841.18 ADAMS M L, LAVASANIFAR A, KWON G S. Amphiphilic block copolymers for d
49、rug delivery J. J Pharm Sci, 2003, 92(7):1343-1355.19 LU W, ZHANG Y, TAN Y Z, et al. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles as novel drug carrier for brain delivery J. J Control Release, 2005, 107:428-448.20 PEPPER M S, TACCHINI-COTTIER F, SABAPATHY T K, MONTESANO R, WAGNER E F. Tumour Angiogenesis M. Oxford, UK: Oxford University Pres
