1、miRNA 常用实验方法一、miRNA 的检测方法miRNA 的 realtime-PCR 检测方法1、 realtime-PCR 引物设计miRNA realtime-PCR 引物设计方法：1）stem-loop RT 引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的 miRNA 序列修改最末端 6 个碱基即可。通用茎环结构序列为：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC例如设计 miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的 RT 引物，只需在通用茎环序列后架上miRNA3末端的 6 个碱基的反向互补序列，即GTCGTATCCAG
2、TGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT2）realtime 上游引物设计：miRNA 序列除去 3端 6 个碱基的剩余部分作为上游引物，如miR-1 的上游引物为(注意把 U 改为 T)：TGGAATGTAAAGAAGT.检查引物的 Tm 值（一般参考DNAMAN） ，如果 Tm 值较低，则在 5端加 GC 使 Tm 值接近 60 度。因此 miR-1 的上游引物可设计为：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4 度。3）下游引物是通用的，序列为 GTGCAGGGTCCGAGGT。4）引物设计好后，需要通过预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解
3、曲线来检测引物的特异性；同时最好将 PCR 产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要 3%以上的琼脂糖胶） 。2、 miRNA 反转录miRNA 的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普通的逆转录酶即可。我们一般使用的是 TIANGEN 的 MLV，逆转录体系为：RNA 500ng2ug5xbuffer 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 补至 10ul程序为（PCR 仪中通常命名为 CTFRT）16 度，30min；42 度，60min；85 度，
4、5min；4 度，hold。！做 miRNA 的反转录时，注意不要忘记内参的 RT，即一个样品至少要做目的 miRNA 和内参两管反转录反应。3、 realtime-PCR 实验miRNA 逆转录完成后得到的 cDNA 即可进行下一步 PCR。在确认引物的特异性后，我们可以进行正式实验。一般每个样品至少需要 3 个平行孔。Realtime PCR 体系为（ABI 定量 PCR仪 需要加 ROX dye II， Biorad 定量 PCR 仪不需要加 ROX）：2X SYBR 10 ulROX II 0.4ul （Biorad 不加）Primer 1ulTemplate 1ulH2O 7.6ul
5、 （Biorad 8ul）需要注意的几点：1）在配制 PCR 体系时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分混匀。这一点是 PCR 平行性的保证。2）配制体系尽量在冰上进行。3）请选用比较准确的枪进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个 96 孔板的 PCR 体系，我会配制 100 个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。PCR 程序：95 度，1min；95 度，5s；60 度，34s（此步在读取荧光值） 。40 到 45 个循环。4、realtime PCR 结果分析realtime PCR 反应结束后返回 Ct 值，可以利用定量 PCR 仪软件自带的程序进行分析，也可以利用
6、 EXCEL 表格进行相对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到EXCEL 表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为 1。其他的样品与之相比得出相对值。EXCEL 表格公式见附件。二、miRNA 靶基因的预测miRNA 靶基因预测软件简介1、 TargetScan：http:/www.targetscan.org/首先选择预测的物种，如果要预测小鼠的 miRNA 和靶基因，则点击右上角的“Go to TargetScanMouse”。第二个选项可输入基因名（有时不识别别名） ，点击 submit 即可，此操作可预测可能靶向该靶基因的 miRNA；或
7、者输入 miRNA 的名字，点击 submit，此操作可以预测该 miRNA 的靶基因。2、 Pictar：http:/pictar.bio.nyu.edu/输入网址后进入 pictar 主页，下面有几个可选用的数据库，一般选用最后两个数据库即可。点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的 miRNA(注意：如果你感兴趣的 miRNA 在下拉菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件)并点击 search for targets of a miRNA 或输入 gene ID（注意：与 targetscan 不同，pictar 一般不识别基因名，最好输入gene 号：NM_*）点击 search
8、 for all miRNAs predicted to target a gene.进行预测。3、 Mirbase：http:/www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl 分别输入 miRNA 名或基因名即可进行预测。其他选项不用更改。预测结果的处理和分析我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，选取两种以上软件预测的交集部分作为我们候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集进行下一步筛选。如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能提示进行挑选。三、miRNA 的过
9、表达和敲低1、 过表达过表达 miRNA 一般可采用两种方法：a 构建过表达载体；b 人工合成成熟 miRNA。a 构建过表达载体1）获取 miRNA 基因的序列及旁侧序列 进入Ensembl(http:/www.ensembl.org/index.html)主页。输入 miRNA 名，点击进入。在 export data 页面上选择输入 5flanking sequence 和 3flanking sequence 分别为 200bp(见下图)，然后点击 next 即可得到包括前体和左右侧翼200bp 的序列。2）基于这段序列，我们可以设计该 miRNA 的表达序列。引物设计原则：扩增产物包
10、括前体，并左右各有至少 70bp 的侧翼序列，长度一般在 200bp-500bp。其他同一般引物设计。载体可以选用任意使用 RNA polII 识别的启动子的载体，包括 T7，CMV 等。常用的是pcDNA3.1，不要带标签的。注意：如果 miRNA 位于 cluster 中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个或两个以上的 miRNA。完成表达载体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。如果目的 miRNA 的表达明确，则载体构建完成。b 合成成熟的 miRNA 序列 查出 miRNA 的准确序列，请公司合成成熟的序列。常用的公司有：上海吉凯；invitrogen 等。2、 敲低目前做内
11、源性 miRNA 的敲低一般使用人工合成的 miRNA 的反义链，即成熟 miRNA 的序列的反义互补序列。如 mir-x 序列为 UCACACAACCCACCACCAUUG，则其 inhibitor 序列为CAAUGGUGGUGGGUUGUGUGA. 将该序列送交公司合成即可。报告基因实验方法一、miRNA 靶基因筛选荧光素酶报告基因实验1、荧光素酶报告基因质粒的构建载体质粒为经过改造的 pcDNA3.1，其图谱见下图。可用的酶切位点为 NotI，XhoI 及XbaI. 推荐优先使用 XhoI 和 XbaI 两个酶切位点。如过不能用，可用 NotI.3UTR of TargetsXhoI X
12、baI靶基因 3UTR 的获得。3UTR 序列是指从 Mrnaz 终止密码子后的第一个碱基开始到mRNA 最后一个碱基（通常是 polyA 结尾） 。模板可采用相应物种的 cDNA 或基因组。在选择模板时要注意：一般来讲，cDNA 适于所有的 3UTR 扩增，但有时 3端 AT 过多导致引物设计困难时，可以考虑用基因组做模板。但是基因组做模板的前提是靶基因3UTR 由一个外显子组成。相关信息可以从 ensembl 中查阅外显子信息可以知道。一般尽可能全面的扩增 3UTR，但如果 3UTR 过长或引物设计困难，可以选取包括miRNA 结合位点的一段 3UTR。引物设计的原则同一般引物设计。2、荧
13、光素酶实验构建好荧光素酶报告基因实验后，准备开始做报告基因实验前，你还需要准备以下材料：1）TK 质粒，作为共转染的内参。2）miRNA 的过表达质粒或合成的 miRNA。质粒的浓度尽量在 500ng/ul 以上，合成的 miRNA 稀释到 20uM。3）状态良好的细胞。1） 分细胞。我们常用 24 孔板进行报告基因实验。分细胞时保证细胞铺板均匀（摇匀细胞的方法见细胞培养的方法） ，每孔细胞数目相当。以 293ET 细胞为例，我们转染的密度一般在 60-80%作用，如果用威格拉斯转染试剂，细胞密度可以稍高些，因为转染后细胞死亡较多。2） 转染。转染时必须配总体系再依次分成小体系。这一步决定着每
14、个孔的平行性和实验的可重复性。转染核酸用量为每孔：luc-3UTR 200ng；TK 50ng；miRNA-pcDNA3.1 1ug 或合成的 miRNA 2.5ul（终浓度 100nM） 。Vig 每孔用量为 1ul，lip2000 为 2ul。转染后 4-6h 换液。如果用 vig 转染必须及时换液，否则细胞会尸横遍野。注意设立合理的对照，通常用 pcDNA3.1（或 miRNA NC）代替 miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做 miRNA 的对照。3） 收细胞。转染 24-48h 可以收取细胞。用生理盐水或 PBS 清洗细胞两次，因 293 细胞极易脱落，建议操作温柔，如果对自己
15、的操作没有自信，可以增大生理盐水量只洗一次。之后吸干生理盐水。每孔加入 80ul 1Xpassive buffer（裂解液的量可视细胞数目稍作调整） ，室温摇 20min，如果细胞裂解充分会看到白色粘稠状细胞碎片。如果不马上测，可连同 24 孔板冻于-80 度，测时再取出解冻。-20 度可保存一周。4 度可保存一天。4） 测定荧光素酶活性。使用中心实验室 108 室 turner仪器进行双荧光素酶的测量。具体仪器操作方法可学习相关教程或请教师兄师姐。我们使用的试剂盒为 promega 的双荧光素酶报告系统：bufferII 为萤火虫荧光素酶的底物，测量数值为我们的报告基因的活性；S&G buf
16、fer 作用是淬灭萤火虫荧光素酶的活性并提供海肾荧光素酶反应的缓冲环境，测定的数值为内参的活性。测定时，取细胞裂解液 8ul 到 96 孔板中（专用的 96 孔板）上机测量。每种底物每孔加 30ul。3、结果分析测定荧光素酶后会返回三个值：萤火虫荧光素酶活性、海肾荧光素酶活性及两者的比值。比值将作为最后的分析数据，反映了该孔报告基因的相对活性。通常将对照归一为 1，实验组与其相比取相对值。此相对值用于最后作图和统计分析。归一方法和作图请自学 EXCEL 或请教其他同学。GFP 报告基因实验1、 GFP 报告基因质粒构建：与荧光素酶报告基因质粒构建方法同。仅仅是用 GFP 取代luciferas
17、e。2、 实验方法及结果分析1） 转染。一般使用 12 孔板进行实验，每孔转染量：GFP-3UTR，200ng-500ng；miRNA，1ug 质粒或 100nM 合成的 miRNA。2） 转染 48h 后，用荧光显微镜照相，观察绿色荧光的强度；收取细胞，用 GFP 抗体检测GFP 表达水平。建议做三个平行孔，结果需要进行统计学分析以判断差异是否显著。二、转录因子调控分析1、 启动子的预测、确认启动子是指 RNA 聚合酶识别并结合的 DNA 序列，并包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。启动子位于转录起始位点附近，而真核基因的转录起始位点通常需要实验进行确定。5RACE 是确定基因转录起始位点
18、的经典方法。在不知道转录起始位点时，我们也可以对启动子进行预测。预测基因启动子的软件有：NCBI promoter scan (http:/www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)等。2、 转录因子的预测通常我们比较关心哪些转录因子可以调控我们感兴趣的基因，这就涉及到该基因的转录因子的预测和鉴定。转录因子的预测软件有：SignalScan http:/www-bimas.cit.nih.gov/molbio/signal/ TF search http:/www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html 等。将待预测的上游调控序列输
19、入进行分析，即可知道该序列中含有哪些转录因子的结合位点。 （说明：这两个软件提供的预测结果不够全，有一些转录因子没有被包括其中。 ）3、 报告基因质粒的构建我们经常使用的质粒载体为 PGL-Basic，质粒图谱见下图。我们要将待分析的启动子序列插入到 luciferase 基因上游。推荐使用 kpnI，XhoI，BglII 和 HindIII 这几个酶切位点，但不建议用 XhoI 和 BglII 双酶切，因为这两个酶切位点有重合。该载体测序用RVP3(正向)和 GLP2(反向)。4、 实验方法及结果分析常见的启动子（转录因子）活性分析实验：1） 连续截短确定核心启动子。克隆基因的上游调控序列，
20、做连续的截短，如构建-2000-1500，-1500-1000，-1000-500，-5000，0500 一系列克隆，转入细胞，观察荧光素酶活性，以此判断哪一段序列对于该基因的转录活性起关键作用。例如：-2000-1500 和-1500-1000 有很高的活性，而-1000-500 活性很弱，则可判断核心启动子区在-1500-1000。2） 特定转录因子对转录活性的分析。我们构建包含该转录因子的启动子序列（上游调控序列）的报告基因质粒，与转录因子的过表达载体（或 RNAi）共转染细胞，观察转染前后报告基因活性的变化。如果转染后报告基因活性发生明显改变，则可判断该转录因子可能调控目的基因的转录。
