1、平时在实验室最常听到的一句话就是“今天某某试验没做好是为什么？今天某某试验没出结果是什么原因？今天某某试验为什么会是这样的呢？” 等等。然后仔细一查找原因，往往是由于操作上面的不认真，或是一些小小的细节没有注意到。以下是集各路朋友的一些经验，与大家分享：1 跑 page 胶的时候，小电压跑会避免高电压产生的热量尔导致的胶层变形。低电压泳道会比大电压泳道跑的直一些，且分离效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分离。2. 提取质粒的时候，最后一步的酒精挥发很关键，基本上是其后续的酶切反应的决定性因素。所以这一步尽量挥发长一点时间，最好是空调吹热风，或是 37 度温箱放长一点的时间，我试过室温过夜，酶
2、切很好。3. 做 WESTERN BLOT 的时候，大家往往会摸索一抗、二抗的浓度，封闭时间，曝光时间等等，而每次变换其中的一个条件就需要从新跑胶、转膜，甚至重新提蛋白，这样会浪费大量的时间。其实完全没有必要这样。一次转膜后，将 PVDF 膜晾干，裁减成小块，保存起来，用的时候取出一块，没有任何影响。这对于摸索条件的战友来说，节约了大量的时间。4. 有关缓冲液和培养基配置1）将缓冲液配方中的成分分别以 10100 倍配成母液储存，需要的时候只需将相应的母液混合，补加水稀释即可2）配培养基时通常会忘记各成分的量，如配 LB 时的三个成分不记得到底哪个是 5g，哪个要 10 个，因此可以在常用的试
3、剂瓶的标签上注明所需的量，如配 LB 时，在 NaCl 瓶外注明10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前临时翻书5. 有关 PCR 主反应液配置:在做克隆鉴定的时候经常需要在酶切鉴定前进行 PCR 鉴定，每次配置 PCR 反应液很繁琐，可以将其配置类似 kit 的形式，按你需要的反应体系列表，然后放大 100 倍配置 100主反应液（100 次反应） ，其中含 buffer，Mg2，dNTPs，但不含引物和 Taq 酶，然后可以 10分装或一管储存在20 度，在需要的时候拿出融开，然后按所需的 PCR 反应个数吸取相应的倍数，再补加相应反
4、应倍数的 Taq 和引物，混匀后分装，这样做的好处如下：1）可极大的节省宝贵的时间，可早点收工，看球2）避免每次反应加样不均的可能3）大大减少 PCR 假阳性的产生6. 有关酶切反应液的配置:在做酶切时，也可以象 PCR 一样配置主反应液，每次反应前先列好反应的体系，算好需要的反应数，然后按所需反应的体系按所需反应数放大，加入 buffer、酶、水，质粒栏空缺，然后混合后按除质粒 DNA 的体积分装，然后再在每管中加入相应体积的质粒 DNA 酶切，这样做的好处如下，特别是当同时有 10 几个阳性克隆需要鉴定时尤为明显：1）各反应成分均一2）可大大减少限制型内切酶的使用3）节省时间7. 有关 S
5、DSPAGE：1）可将 SDSPAGE 的积层胶，分离胶预先配好大体积如 100ml 储存在 4 度冰箱（注：10 AP，TEMED 不加，切记！） ，每次配置时只需吸取相应体积的预制胶加入AP，TEMED 即可，没必要每次制胶时候翻分子克隆，特别方便，而且，这样的预制胶可储存半年以上，不失为偷懒的绝佳方法；更关键的是可大大减少与丙稀酰胺的接触，因此大大减少中毒的机会。2）电泳时虽然小电泳分离效果要好一些，但 2 小时以上的等待的时间实在是痛苦，因此可以提高电泳至 150V，但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热，这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差，关键是时间大大节省，不需 1h
6、即可看结果了8. 实验中小窍门我想能够分成两类：一类是“ 非常规”操作；一类是常规操作过程中一些省时省事手段。前一类，我举个例子：有时候第一天涂的转化平板、次日早晨转化子可能长成的菌落比较大（12 毫米以上，BL21 就长得快） ，下一步转化子做质粒鉴定。这个情况下可以直接挑取一块菌苔（勿带出培养基） ，50 微升酚/ 氯仿悬浮菌体，放置两分钟，加 40 微升 TE 抽提，上层 TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上层 TE 即是质粒提取液。提取的质粒可以直接用于电泳和酶切。这样操作，可以省去转接液体试管的培养步骤，至少节省 68 小时的时间。但是，要在各步骤都控制得很好的情况下才能保证提取和酶切
7、的效果，不同的实验室或者操作者未必能够很方便地重复-其实，其它的一些“小窍门” 也是如此。后一类的小窍门则在实验室中无处不在。如：平行作不同样本的 PCR,模板 DNA 加量一样，配置 PCR 体系可以一起配制后分装-这点做过试验的都知道，但是配制的时候配制量可以比预期分装量稍多一点（如用 100 微升则配 110 微升） ，这样可以避免有时候分装不够的尴尬，因为不同特别是大小不同的枪，会有误差。再比如：楼上有站友说的 sds-page 胶预配（APS 和 TEMED、或者后者先不加）的问题，实际上时间放置过长肯定影响效果，如果要在一天内连续地跑两次板，何尝不可？又比如，配 sds-page
8、胶的时候，上层胶和下层胶可以只用一个大枪头：先取胶，次取水，取 6.8 的 tris 后再取 8.8 的 tris，省时省料。20021108 站友开的这个帖子很好，在上上层楼的帖子说得也有道理。但我想， “窍门”和“偷懒”不应该是因果关系。其实，不管是那一类的小窍门，都是在充分地理解实验各步骤的原理、经过多次试验积累、再加上一点点思索然后尝试的结果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否则，别人的小窍门对你也未必能够有用。才进实验室的新手，务必要先练好规范扎实的操作，然后才能弄“窍门”。本末倒置，贻害无穷。9. 我一直是把 SDSPAGE 的积层胶，分离胶预先配成 mixture，A
9、PS 制胶时加入，半年内使用，绝对没有问题，我保证。10. 做 SDS-PAGE 的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的 band 能做到一样宽，方便后面的比较，特别是 WB。做法就是拿 1X 的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的。11. 在把蛋白胶做成干胶时，很多时候会因为有气泡使胶裂掉，我的经验是在做胶时加上层膜前在胶上多加些水就不容易进气泡了，还有就是高温烘胶，我喜欢放到 60 度烘箱里烘，这样水分蒸发速度快，即使有一些小的气泡也不会有影响，呵呵，这是经验之谈，我从来都没失手过，大家可以试试12. 做大肠
10、表达时确定蛋白是否表达一般要煮样做诱前诱后检测,但很多时候煮出来的很黏影响跑胶效果.我发现如果现用 8M Urea 重悬细菌再煮效果会有极大改善.注: 不能用 Gu-HCl 代替13. 我也推荐几个偷懒的方法1 做 SDS-PAGE 跑胶通常都是现配现用,但配胶要1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上 ,注意玻璃板上下两边缘会有气体 ,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放 4 度过夜 .第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期.2 配置分离胶或者非变性
11、胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入 4 度以降低凝聚速度,而将凝胶放入 37 度促聚,并随时用 4 度加剩的胶补充下降的胶面.另外将胶横放与水平面成10 度角也可以减少收缩的影响.3 推荐一个节约抗体/时间的做法:同时跑 2 块胶,同时转膜, 然后两块膜背靠背放入同一封口膜同时封闭,同时一抗二抗(最好是用转轮,这样效果好 .如果是摇床, 隔一段时间帮它们翻个身以保证两张膜的正面都有机会与液体充分接触.一起洗膜(可以稍微加强洗膜也可以不做 .我最多一张盘子里放 4 张膜而没有影响洗膜).可分别或同时压片.这样就可以节约一半抗体和接近一半时间而不会影响结果.或者另外一个就是孵育后
12、的抗体不要扔,好的抗体可以反复做好几张膜呢.但每次都会减弱,效果不如上面一种方法. 14.做 western blotting 转膜时，胶放在转膜缓冲液中一段时间，待胶在含有甲醇的缓冲夜中缩小的差不多后装 好转膜装置，我的经验是把膜印在胶上直接在膜上画出预染 maker条带，方便的很。因为很多时候跑电泳时胶上的预染 maker 很清楚，等转膜后就不是分辨的很清楚了。不过要注意画好预染 maker 后就不要使胶和膜发生对位移动了，以防 maker失去参照价值。15. 超滤最合适用于蛋白的浓缩，更换缓冲液和除盐，对于按照分子量进行初分离的效果不是很好，理论和现实是有很大差别的_16. 关于 Wes
13、tern Blot1）器具的清洁非常重要，开始做前，为了安全，尤其是装胶的厚薄玻璃板，可以先用中性洗涤剂和自来水反复冲洗，确保无洗涤残液后用蒸馏水冲洗 23 遍，然后用去离子水冲洗一遍。最后用 95酒精再擦一遍后晾干备用。2）配胶最好现用现配，先配下层胶（分离胶） ，后配上层胶（浓缩胶或积层胶） ，而且在临灌胶前加 APS 并迅速混匀，即用移液枪抽吸与注入 12 次即可。17 跑蛋白 page 的时候，一开始用加样针，太麻烦，发现用 20ul 枪+普通小白枪头点，非常省事。另外，点样时有可能看不清孔在哪，看远离你的那面胶，孔有反光的。点样也点你对面的那块胶，省的总低头，干咱这行的容易得颈椎呀，
14、爱惜自己。18. 垂直电泳时，可在电泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影响电泳，又很节约电泳缓冲液。19. 我们有时要沉淀东西时，由于沉淀量很少，离心完之后不知道到底有没沉淀下来东西，由于量很少，不好观察，所以离心时建议按特定的方向放置离心管，这样你就可以在离心之前确定沉淀该沉淀到管子的大致部位，这样离心后就可直接观察那有没有沉淀，避免满管子找，另外看沉淀时可以对光看，这样就是颗粒状的细小沉淀也能看见的。20. 大家都知道 PMSF 有剧毒，以前都是知道浓度和要配的体积的基础上,算出要称多少毫克的 PMSF,其实也可以先称 PMSF,称多少算多少, 再调整异丙醇的体积，到达你所要的浓
15、度。这样就避免了你长时间和它接触。21. 跑好 SDS-PAGE 胶的一些体会。1. 清洗好玻璃板，不要偷懒，很多时候跑完电泳撬胶时会因为玻璃板不干净胶粘在板上把胶撬破。2. 配胶时不要反复用枪混，稍微摇混就可以了，用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。3. AP 分装成 500 微升一管保存放-20 度，避免 AP 用太久失效。4. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干，因为微量的水存在会影响配的胶浓度。5. 尽量不用过夜放室温或者四度的胶，也回影响胶 的分离效果。6. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板，在一平皿里装好水，把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来，一点没有问题，方便的
16、很。7. 点样时样品别忘了离心这步，因为上样含有固体沉淀会影响电泳图分辨效果。8. 尽量在冰浴状态下跑。22. 做 做的比较多，总结了几个小窍门：一向电泳时，盐离子容易聚在 胶槽的两侧剪一小段胶条放在 两侧，构成盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验 结果 SDSPAGE 时,在灌胶之前 ,一般大家都会用凡士林封底, 在 SDSPAGE电 泳之前又必须把凡士林搽干净, 很是麻烦,我的经验是:不用凡士林,取少量未加 Ap 的分离胶,按比例加 2 倍量的 Ap,然后灌入板间 ,等上几分钟,待胶凝固后就可以接着灌分离胶了 .方面,效果好!23. 蛋白质纯化时，蛋白质降解可能与超声破菌保持
17、冰浴有关，之前建议加 pmsf，建议在上柱子洗脱的时候也加 pmsf（蛋白降解抑制剂） ，一定要用之前再加。24. 做透析的时候，拿一个 5ml 的枪头或者是其他类似的东西，剪短，穿过个塑料泡沫之类的面积比烧杯大东西，然后把透析带一端扎紧，另一端开口绑紧在 5ml 枪头下端，扎紧得那端也可以弯过来绑成 u 字型。这样就可以用 1ml 的枪穿过 5ml 的枪头的孔，另一只手调整透析带，来加样取样，省去了总绑透析带的麻烦，对同一个蛋白大量多次透析非常方便25. 第一次发贴说一下自己的小经验，希望版主能给我一分，每次看到好东西因为没分都没法下，好羡慕有分的人啊。当然也不能不劳而获，说一下自己的实验技
18、巧给大家分享。1. 配 SDS-PAGE 胶时，用枪头混匀比较麻烦，而且费时费力，效果也不好。可以剪一小段夹文件的那种曲针做转子放到配胶的小烧杯里，在磁力搅拌器上边搅边加入各溶液，这样加完也就混匀了，直接灌胶即可。2. 上面的站友也说过，上样用黄枪头就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建议大家也试试。3.电泳后考马斯亮蓝染色一般要 1h 到 2h，脱色也要 2h 左右，麻烦的很。现在给大家说一个简单的方法，是我从一个师姐那里学到的。加入染色液后，先放入微波炉里加热 5-10 秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了） 。然后放水平摇床上摇 20 分钟，最多半小时就染
19、好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸 5 分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上 1/5 的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液） 。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。26. 我也说说我的小经验。可能大家都知道，请别笑话我。1、配胶时一定要掌握好时间，不要因为过度赶时间，而造成以后的条带粗大，压不成条带，且消耗很多试剂和时间。2、加样时，冲洗加样器可用双蒸水，用电泳液会使加样器中有很多的泡沫。或许是因为SDS 的原因吧？3、对于大分子蛋白
20、质，转膜过夜更好。滤纸的张数可以适当减少。4、在跑样时同时加入 MARKER 有助于正确识别所需的蛋白位置，减少 NC 膜的消耗。5、一抗、二抗的浓度不要太高。6、做 ECL 显影时，根据荧光的亮度调整时间。泡完显影液，胶片应用水洗一下，以减少定影液变黄。7、和有经验的同学交流，也是非常重要的。知识的交流绝对有助于试验的成功。这是我目前的一点拙见。27. 推荐一个省质粒试剂盒硅胶柱与溶液的方法：所有试剂使用手提质粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替试剂盒的solution1、2、3） ，然后一比一的与饱和碘化钾或碘化钠（代替结合缓冲液）混合，就可以让质粒在硅胶上结合，而试剂盒的硅胶柱可以重
21、复使用，没有试剂盒溶液量的限制，只要是一样的质粒我想提几管就提多少。顺便说一句硅胶柱也可以用自己买的硅胶粉末代替，离心后倒掉硅胶柱上面的上清就可以，用起来不象柱子方便。效果比手提的要好要快。28. 做 WB 时,样品比较多, 又怕放时间长了对蛋白样品不好 ,而且确定以后肯定要做某个抗体,只是一时没有决定.那么你可以选择先做 SDS-PAGE,并转膜. 然后把 PVDF 膜凉干, 放四度保存. 以后拿出来封闭后,加抗体就行了 . 蛋白在膜上, 且已经分离 , 比保存在 BUFFER 里面的蛋白肯定更可靠。呵呵29. 今天作 his 纯化的时候，又琢磨了一个窍门，与大家分享。我得样品比较多，几百m
22、l，而柱子不够大，只有 10 几 ml，跑来跑去的上样，还总得记着，太麻烦了。于是，我就刷干净了一个烧杯，装了我的样品，找了一个细胶皮管，当连通器，就像鱼缸换水一样，用 5ml 枪在一头一吸，液体流出来，放到纯化柱里，调好烧杯的位置，两个液面一样平了，呵呵，上了好几个小时了，没有问题，现在调低速度，过夜上样：）30. 能导致 PAGE 胶不凝的原因主要有三个：1、配胶中用到的主要试剂的配置。主要就是 30的丙稀酰胺的配置。 粉末状的丙稀酰胺和甲叉丙稀酰胺使用不应该超过一年，因为丙稀酰胺会吸潮水解，这样以来丙烯酸的含量就会加大，从而导致 page 胶不凝。2、温度。温度高时凝固快，但是亦不宜过高
23、，因为温度变化会影响交连物的孔径大小。所以温度在25 度最为合适。3、氧气。氧气是凝固的终止剂，所以不能让胶中出现气泡。虽然都是些看起来听低级的错误，但是不注意还是会犯。31. 我做 2 维蛋白电泳，也有些心得：1、向电泳玻璃板内加入胶条时，先在缝隙中加入配好的溴芬兰缓冲液，要加满，再将胶条贴后面玻璃板壁用薄塑料片将胶条缓缓推下至凝胶上缘，这样可以很好的避免胶条下形成空气泡。2、 能做出好的图谱已经很不容易了，如果在扫图时撕破实在可惜，所以扫图要小心，将凝胶转移到扫描仪时可以用塑料隔片在下面托着，同时保持有些水，这样就安全多了。32. 凑个热闹说两句吧1、 sds-page 胶如果配好装好倒入
24、内槽液以后，发现内槽液稍有渗漏，可以把外槽液多加一些，加满，加到与内槽液相齐，这样就可以继续正常跑胶，不用浪费已经加进去的内槽液2、至于染色脱色的问题，我们这里一直是染色：加热半分钟，摇 20 分钟；如果染液不是新配的，就加热半分钟摇十分钟，凉透了再重复一次即可脱色也一直是用去离子水煮两三次即可3、不知道大家都是怎么做酶切的，我的体会是，酶切质粒时，两个酶分别单酶切比直接双酶切效果要好很多。我有一次双酶切两次都没连出来，后来分步单酶切，连接效率几乎100%。可以第一个酶切完后直接把体系热失活， （根据酶说明书上一般是 65 度 20min）然后直接向里面补第二个酶或者第一个切完后用氯仿抽提，把
25、蛋白提出或者中间做一次回收，这个就要考虑回收效率和损失的问题了，但是这样除蛋白最彻底前两个方法我们这都是有人做过的，已经都很好用了33. 俺也来说说关于 Bradford 法蛋白浓度定量和 DTNB 法巯基浓度定量的一点体会：我是做蛋白修饰巯基后，通过这两种方法的定量来间接反应修饰的程度。一路摸索过来，也有半年有余；最大的体会就是不要急于求成，直接实验，首先检测修饰体系是否对方法有影响，修饰基团是否会在 595nm 和 412nm 下有特定的吸收，修饰后修饰试剂本身是否会有变化，对蛋白整体结构造成影响，其次再谈具体修饰比例和程度。对于巯基浓度测定方法，有四种（Anal Biochem. 199
26、8 Dec 1;265(1):8-14） ，而 DTNB 本身虽然灵敏度不高，但是重复性和抗干扰是最佳的了。34. 考马斯亮蓝染色后的脱色，如在脱色液中加数张捏成条状的 Kimwipes 纸（国外实验室常用，相当我们的擦镜纸，全棉纤维制造） ，由于染料吸附到纸纤维上，脱色加速。 待纸着色较深时，更换新纸条，不用换液。我想脱脂棉或纱布也是一样的。但滤纸等可能不行，会溶掉。半贴壁细胞如 SP/0 或杂交瘤细胞传代时，不用吹打或刮落。先将上清吸出，适当拍打培养瓶（当然是塑料瓶，玻璃瓶拍碎了别找我） ，即可见贴壁细胞脱落，加培养基混悬即可。注意，过力拍打培养瓶会裂，特别是瓶颈。35. 一向电泳时，盐离
27、子容易聚在 胶槽的两侧剪一小段胶条放在 两侧，构成盐桥，电压就容易上去了避免一向电泳不好影响最后实验 结果36. 我也推荐几条：1、关于 20021108 战友的说法，我觉得我们制备好了一批感受态，最好马上转化一种已知质粒，与此同时，取一点感受态接种到含抗性的固/液体培养基培养来做对照。这样第二天即可以知道这批感受态是否还有外源质粒，又可以知道这批感受态转化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因为我也曾经遇到其实是因为感受态不好而导致试验不成功，但是当时不知道，结果费时费力。2、做克隆挑斑时，我们可以在将沾有菌体的牙签丢到试管前，在一块相应抗性的平板上点一下，标注清楚，培养时间稍长一点
28、，待长成较大菌落后收取。以后需要哪一个菌,就在平板上挑取。这样既方便快捷，又可以保证菌的一致。3、抽提质粒时，加入 Sloution II 和 III 后要求轻柔混匀。我个人觉得不用这样，只要不是非常剧烈，可以快速混匀。尤其可以运用在一次抽提多管质粒的时候，这样可以快速，而且效果一点也不差。4、抽提质粒时，用无水乙醇沉淀的时间可以由实验操作者来决定，如果时间充裕可以30min，否则 8-10min 也可以。至于温度，个人觉得-20 度好于常温。如果加入可醋酸钠，会较容易形成盐类杂质，所以时间短一些更好！今天想到这些，先写到这里，以后想到了在上来与大家分享。希望我的小经验对大家有所帮助！37.
29、首先声明：实验中的一些技巧要用在首先对基本的操作有深刻了解的基础上，在力求省时、省力、节约成本等的同时，实验的准确性是最重要的。对大多数做蛋白的战友们来说，培养细胞应该是不陌生的，我这里谈一个培养细胞的小技巧，大家知道，对于一定的空间（如某种尺寸的细胞培养瓶）来说，细胞数目太多或者太少都不利于其生长，太多了就要消化，太少了要换一个小点儿的培养瓶，我的做法是：如果细胞数目太少，可以不必去找小一点儿的培养瓶，可把原来的培养瓶由原来的平放改为竖着放，这样底部的空间就小了，有利于细胞的生长，当细胞数目增加到一定程度的时候还可以在平过来，避免了来回换培养瓶而增加污染的机会（对没有小培养瓶的更实用） 。个
30、人体会，仅供参考。38. 说说关于 SDS-PAGE 的几个小经验1、做好胶后，把所有的加样孔都加上样，这样可以防止边缘的样品脱尾。2、高电压/高电流电泳时，可以把电泳槽放到 4 度冰箱中进行电泳，省时省力，1hr 搞定。3、胶考染时间 40min，放在凝胶摇床上（没有胶床可以放到 28 度普通摇床上，但要控制好摇床速度）缓缓摇动，使染色均匀，同时可提高检测的灵敏度，根据我的经验可以达到银染的级别，就是脱色时间比较长，一般需要脱色 23d，夏天的时候要勤换脱色液，防止变臭哦 39. 质粒小提如果是用作鉴定或酶切，不必进行酚仿抽提，将溶液 1.2.3 离心后的清液移入一个新的 1.5ml 离心管中，再次离心 3-5 分钟，小心取出上清液后，直接沉淀，不必担心DNA 切不开，我已经这样使用一年多，没出过什么问题。当然这样的质粒不很干净，但是做鉴定足够了。尤其是实验室女同胞们，可以减少酚仿的侵害，而且节省时间。
